肿瘤转移新进展和机制

肿瘤转移新进展传统认识早期肿瘤肿瘤增大并且生成血管和淋巴管淋巴管肿瘤细胞挤入血管和淋巴管中通过血液通过淋巴循环系统中的肿瘤细胞肿瘤细胞早期转移肝细胞肿瘤黏附于血管壁并且通过血管壁进入血管以形成远处转移淋巴结转移灶淋巴结肿瘤细胞从原发灶脱落进入循环系统，这种情形发生在大多数肿瘤中并在肿瘤形成的早期阶段即可发生。然而，只有少数播散的肿瘤细胞能够形成可见转移病灶。血管壁的紧密连接、远处脏器非适宜环境及以正常器官对入侵肿瘤细胞营养供给的限制是转移灶形成的障碍之一。新生血管的不完整性使得肿瘤细胞得以进入的循环系统。这种不完整性是否也有利于循环肿瘤细胞从循环中回归？肿瘤细胞不需要进一步的适应原发肿瘤微环境便能够进入活跃状态。肿瘤转移是否涉及自身的种植转移？TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells•我们一直认为癌细胞离开原发肿瘤转移到远处脏器是一个单向的过程。•最新研究表明，循环肿瘤细胞(CirculatingCancerCells,CTCs）也能够移居到原发肿瘤，这个过程称之为“肿瘤自种植（TumorSelf-Seeding）”。霍华德休斯医学研究所斯隆-凯特琳癌症中心肿瘤生物学和遗传学项目TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells.Cell.2009Dec24;139(7):1315-26.新进展TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”现象是否存在？一、“self-seeding”现象•1.将标记GFP-荧光素酶的MDA231-LM2（人乳腺癌肺转移细胞亚群）接种于小鼠的一侧乳腺，构建—“释放”瘤体•2.将未标记细胞接种于对侧乳腺，构建—“接受”瘤体•3.60天后将“接受”瘤体切除，并应用体外生物发光成像技术检测瘤体是否存在标记的肿瘤细胞。发现在85%的“接受”瘤体内能够检测到标记的肿瘤细胞。荧光显微镜下观察“接受”瘤体的冰冻切片RT-PCR检测在“接受”瘤体内含荧光标记mRNA肿瘤细胞约占整个瘤体细胞数的5%-30%。现象的普遍性与空白对照组比较转移灶播散的肿瘤细胞能否侵入到“接受”瘤体内？•首先将荧光标记的肿瘤细胞由尾静脉注入小鼠体内，确定形成肺内转移瘤后，在小鼠乳腺建立“接受”瘤体模型。•10/11(91%)小鼠“接受”瘤体内发现荧光标记肿瘤细胞•循环肿瘤细胞的含量与自我种植肿瘤细胞的含量呈正比TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”现象是否存在？存在二.在肿瘤细胞群体中，哪一细胞亚群来完成“TumorSelf-Seeding”？•SW620,A375,MDA231：祖代细胞vs转移性细胞亚群转移性细胞亚群自我种植能力为祖代细胞的8-35倍！自种植肿瘤细胞亚群分析人乳腺癌细胞株MDA231人黑色素瘤细胞株A375从一侧乳腺“释放”瘤体种植到对侧乳腺“接受”瘤体的能力比较。＞100倍从血液循环中种植到“接受”瘤体能力比较。6倍穿血管内皮层迁徙能力比较。4-6倍S1代细胞基因特征基因表型特征与动物实验结果相吻合TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”现象是否存在？存在二.在肿瘤细胞群体中，哪一细胞亚群来完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何实现的？具体机制？三、“self-seeding”机制研究初步机制1.构建小鼠乳腺肿瘤模型（“接受”瘤体、未作标记）。2.10天后经左心室注射表达LacZ/GFP/luciferase的MDA231“循环细胞”。3.LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，LacZ基因编码的beta--半乳糖苷酶，可催化乳糖的水解。Beta-gal比较稳定，用X-Gal(5-N-4-氯-3-u2115,tt–beta--半乳糖普）为底物进行染色时，呈蓝色。1.注射肿瘤细胞后其立即在体内广泛分布。2.0-7天逐渐清除，从7天开始仅在“接受”瘤体内局限分布。3.42天图，标记肿瘤细胞在“接受”瘤体内，而模拟接种组的乳腺内无种植。瘤体因素4.转移性细胞株比其祖代细胞更具种植于“接受”瘤体的能力。循环肿瘤细胞因素1.“接受”瘤体的因素推论与假设2.循环肿瘤细胞的因素吸引循环肿瘤细胞？响应“吸引”浸透瘤体？条件培养基：肿瘤细胞生长过的培养基正常细胞生长过的培养基实验验证---穿血管内皮迁移试验与正常细胞条件培养基相比，在肿瘤细胞条件培养基条件下循环肿瘤细胞更容易实现穿血管内皮迁移。实验验证---穿血管内皮迁移试验肿瘤条件培养基：祖代肿瘤细胞条件培养基转移性亚群肿瘤细胞条件培养基结果一：在两种肿瘤条件培养基条件下相同的循环肿瘤细胞具有相同的穿血管内皮迁移能力。结果二：转移性肿瘤细胞亚群较其祖代细胞更具穿血管内皮迁移能力，且与肿瘤条件培养基的种类无关。一、“接受”瘤体的肿瘤细胞释放某种信号来吸引循环中肿瘤细胞穿透血管内皮层。二、高侵袭性肿瘤细胞较其它亚群肿瘤细胞更具响应“吸引”实现穿透血管内皮的能力。实验结论“吸引”相关调节因子为了进一步研究具体的肿瘤源性吸引因子，筛选肿瘤条件条件培养基中180种细胞因子的分泌水平。分析发现与普通条件培养基相比，肿瘤条件培养基中含有更高水平的IL-6,IL-8,oncostatinM,andVEGF；和更低水平的CCL2。分子机制实验验证正常细胞条件培养基中加入IL-6orIL-8，进行肿瘤细胞穿膜迁徙试验：A图：未加血管内皮层B图：添加血管内皮层。A体内IL-6,IL-8在吸引循环肿瘤细胞中的作用？•研究发现IL-8对MDA231的迁徙无明显作用，进一步研究表明这种肿瘤细胞不表达IL-8受体。•应用RNA干扰技术将S1代细胞的IL-6R基因及其转录相关正调节因子IL6ST基因封闭后，其自我种植率明显降低。“渗透”相关调节因子转移性相关基因在MDA231-S1亚代中的增强表达说明循环肿瘤细自我种植优先涉及到具有转移潜质肿瘤细胞亚群。为了明确介导渗透功能的相关因子，研究人员从表达在原发乳腺癌肿瘤并证实与乳腺癌复发相关的因子中进行筛选。筛选标准：在原发肿瘤细胞内表达的这些因子赋予肿瘤细胞潜在的侵透优势，正如介导肿瘤细胞侵入的循环中一样。•研究发现：三种基因符合标准，胶原酶-1（基质金属蛋白酶-1）、成束蛋白-1、CXCL1（趋化因子）。这三种基因的均涉及到侵袭和渗透功能，重要的是其在原发乳腺癌细胞中的表达与肺转移和脑转移有关。•基质金属蛋白酶MMP-1：几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。•Fascin-1：成束蛋白，是肌动蛋白结合蛋白中与癌细胞运动时丝状伪足、微棘异常形成有关的主要分子。已证实与恶性胶质瘤和结直肠癌的迁移和侵袭能力有关。•CXCL1：是一小分子的细胞因子属于CXC趋化因子家族，又被称作生长调节致癌基因α，参与新血管形成、炎症反应、伤口愈合和肿瘤形成。实验研究•应用实时荧光定量PCR技术检测发现S1肿瘤细胞内的FSCN1,CXCL1,andMMP1表达水平是其祖代肿瘤细胞MDA231的11倍--100倍。应用RNA干扰技术将S1内三种基因做不同模式的封闭，再进行穿血管内皮迁徙试验，以此来观察这些基因在肿瘤“种植”中的作用。应用应用RNA干扰后三种基因的表达情况基因封闭后的肿瘤细胞在穿血管内皮试验中的表现1.单独封闭MMP1或CXCL1，对穿内皮迁徙能力无影响。2.FSCN1的封闭明显降低迁移能力。3.联合封闭MMP1和FSCN1进一步降低其迁徙能力。4.CXCL1和FSCN1的联合封闭无进一步降低。对MMP1或FSCN1得封闭对乳腺肿瘤细胞的生长无影响。相应动物试验中也得出了相似的结论•IL-6，8在瘤体吸引循环肿瘤细胞的过程中具有重要调节作用。•FSCN1和MMP1在循环肿瘤细胞再次渗透到肿瘤的过程中具有重要调节作用。实验结论TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”现象是否存在？存在二.在肿瘤细胞群体中，哪一细胞亚群来完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何实现的？瘤体“吸引”IL-6,8循环肿瘤细胞“渗透”FSCN1,MMP1四.“TumorSelf-Seeding”后的影响？背景：多项研究证实侵袭性肿瘤细胞可能通过旁分泌形式释放某些刺激信号促进肿瘤血管形成和营养性细胞基质的募集以此来促进肿瘤细胞的生长。(Carmeliet,2005;CoussensandWerb,2002;JoyceandPollard,2009;TistyandCoussens,2006)循环肿瘤细胞“self-seeding”后是否释放某种物质反作用于“接受”瘤体？四、“self-seeding”影响小鼠乳腺建立MDA231肿瘤模型，10天后经循环系统注射LacZ/GFP/luciferase-表达的MDA231-LM2细胞，发现与空白对照组相比，研究组瘤体明显增大。实验研究“接受”瘤体的增大是因为其细胞数量的增加而不是因为其密度的减低。组织切片的β-半乳糖苷酶蓝色发现LacZ+种植细胞约占整个“接受”瘤体内肿瘤细胞数量的7%-19%，这一数量并不能与瘤体的增大一致。少量MDA231-LM2细胞种植于“接受”瘤体后能够通过旁分泌途径释放某种物质到细胞外基质中以此促进肿瘤细胞生长，提高其生长率。实验结论机制？通过数字图像定量分析肿瘤脉管CD31染色，发现“接受”瘤体内毛细血管分支的长度和宽度增加。CD31是一个血管内皮细胞表面130KD的糖基化蛋白质。免疫组化检测泛白细胞标记CD45，“接受”瘤体内白细胞迁移增多。进一步分析发现，在“接受”瘤体内中性粒细胞和巨噬细胞（CD68+）增多。应用RNAi将“自种植”肿瘤细胞的CXCL1封闭与封闭MMP1和FSCN1不同，封闭CXCL1并不能减少MDA231cells穿血管内皮细胞迁徙和“自我种植”程度；但是，明显减少对粒细胞的募集。CXCL1是一小分子的细胞因子属于CXC趋化因子家族，又被称作生长调节致癌基因α，参与新血管形成、炎症反应、伤口愈合和肿瘤形成、促进肿瘤细胞的增殖。TumorSelf-SeedingbyCirculatingCancerCells一.“TumorSelf-Seeding”现象是否存在？存在二.在肿瘤细胞群体中，哪一细胞亚群来完成“TumorSelf-Seeding”？S1代三.“TumorSelf-Seeding”是如何实现的？瘤体“吸引”IL-6,8循环肿瘤细胞“渗透”FSCN1,MMP1四.“TumorSelf-Seeding”后的影响？“TumorSelf-Seeding”的循环肿瘤细胞在瘤体内释放的CXCL1能够促进肿瘤血管生成、促进胞外基质成分的募集、促进肿瘤生长。早期肿瘤肿瘤增大并且生成血管和淋巴管淋巴管肿瘤细胞挤入血管和淋巴管中通过血液通过淋巴循环系统中的肿瘤细胞肿瘤细胞早期转移肝细胞肿瘤黏附于血管壁并且通过血管壁进入血管以形成远处转移淋巴结转移灶淋巴结五、讨论•肿瘤细胞的“self-seeding”是对高侵袭性、高转移潜质细胞群的选择。•“肺内的转移灶释放的循环肿瘤细胞能够种植于乳腺原发瘤体”提出了一个可能性：肿瘤切除后的“再种植”可能是最终局部复发的潜在机制。•“Self-Seeding现象的发现为癌症治疗过程中的临床观察提供了新的视角，医生都知道肿瘤的大小和预后的好坏有关联。人们通常认为大的肿瘤会释放更多的具有转移潜力的癌细胞，从而导致预后效果较差。但实际上这种关联可能是侵袭性癌细胞的“self-seeding”造成的，类似的机理还促进了局