LAMP技术原理与应用

1LAMP技术原理及应用陈蕾北京蓝谱生物科技有限公司E-mail:[e-mail]:010-82101210/1Mob:[e-mail]:010-82101210/1Mob:[phone]从样本中抽取、提纯DNA、RNA检测基因扩增检测基因扩增基因检测的流程基因检测的流程扩增检测二步反应PCR扩增检测一步反应LAMP3LAMPLAMP法和法和PCRPCR法的比较法的比较简单、快速、准确的基因扩增法LAMPPCR温度◎反应全程恒温△必须要有热循环时间◎约１５～６０分钟△２～３小时产物量◎约１０１０倍(100亿倍)△约１０７倍(1千万倍)特异性◎极高６区域４引物△２区域２引物检测◎无需其他检测步骤，根据扩增反应发生与否判断△需其他检测步骤试剂◎无需特殊试剂◎无需特殊试剂4LAMP法的引物设计LAMPLAMP法的引物设计法的引物设计5LAMP法使用的酶LAMPLAMP法使用的酶法使用的酶链置换型链置换型DNADNA聚合酶聚合酶::BstBstDNAPolymeraseDNAPolymerase①引物双链DNA聚聚②引物双链DNA解离的同时・・・聚聚③引物持续链伸长聚聚解离下来的单链DNA•扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链伸长。•LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。6w解离链w结合5’F1c5’TargetDNA(3)3’F3cB1F2cF1cB2B35’F1c5’3’F2B1cB2cB3cF15’F1cF23’(2)(1)F3cB1F2cF1cB2B35’3’F2B1cB2cB3cF13’F3cB1F2cF1cB25’3’B3F3cB1F2cF1cB25’3’3’F2B1cB2cB3cF1F3B3FIPF3Primer＋F3cB1F2cF1cB2B35’F3F1F2B1cB2cB3c5’3’(4)F1cF2B1cB2cB3c5’3’F13’w结合w结合w解离连w结合＋(5)(7)F1cB1cF2F1B2cB3c5’3’F1B1F2cF1cB2B33’5’(8)F1cF1F2cB15’3’B3PrimerB1cB2F25’F1B1cB2cB3c3’3’5’F1cB1cB25’BIP(6)F1cB1cF2F1B2cB3c5’3’F1F2cF1c3’5’B2B1cw环状构造w环状构造w环状构造LAMPLAMP法的原理法的原理①①哑铃状模板构造的形成过程哑铃状模板构造的形成过程7LAMPLAMP法的原理法的原理②②扩增循环扩增循环BIP(8)(9)(10)(11)F1F1F1cF1cF2F2cF1F1F1cF1cF2F2cF2cB1B1cB1B1B1B1cB1cB2cB2B1B1cB2cF1F1cB2cF1F1F1cF1cF2F2cB1B1B1cB1cB2cB2F1F1F1cF1cF2F2cB1B1cB1cB1B2cB2B2FIPF2cF2F1F1cF1cFIPB1B2cB1cF1cF1F1cF2F2cB1B1cB2B2B1cB2B1cF2F1F1cB1B1cB2cBIPB2B1cF28アニメーションアニメーション9环引物的应用环引物的应用①①(8)LoopPrimerB(11)LoopPrimerFF1B1B1cB2F1cF1cF2cF23’5’B1cB2F1cB1F1F2B1cB2c3’5’10环引物的应用环引物的应用②②PSA癌症转移标志基因CYP2C19公牛特异性序列HBVλDNA快速法（LoopPrimer：有）标准法（LoopPrimer：无）RNADNA11Mg2P2O7P2O74-+2Mg2+(Whiteprecipitate)DNAPolymerasePPi=P2O7dNTPsMg2+,DNADNA-(dNMP)n+nPPiLAMP法结果判断方式①①----目视检查混浊12Mg2P2O7P2O74-+2Mg2+(Whiteprecipitate)DNAPolymerasePPi=P2O7dNTPsMg2+,DNADNA-(dNMP)n+nPPiLAMP法结果判断方式①①----目视检查混浊13LAMPamplificationCalceindNTPsMn++UVquenchingCalceinPPi+Mn++Mn2P2O7UVfluorescence＋－Mg++Mg++LAMP法结果判断方式②②----目视检查绿色荧光14误区：染料采用SYBRGreenI误区：染料采用SYBRGreenI¾反应前加入：抑制LAMP反应¾反应后加入：违背了LAMP不开盖原则¾SYBRGreenI染料灵敏度高，20pg的DNA也能检测出，不能特异性地指示LAMP产物¾反应前加入：抑制LAMP反应¾反应后加入：违背了LAMP不开盖原则¾SYBRGreenI染料灵敏度高，20pg的DNA也能检测出，不能特异性地指示LAMP产物15Real-timeturbidimeterLA-320cTime(min)Turbidity-0.100.10.20.30.40.50.60.70102030405060Time(min)1061051041031021010copies/reactionTurbidityPurifiedHBVgenomicDNAwasusedasatemplate.实验室方法建立阶段----推荐采用标准法LAMP检测16推荐理由推荐理由¾采用闭管扩增，可从源头上控制气溶胶污染¾实时检测，可根据各引物反应时间、效率筛选最佳引物及反应浓度¾LAMP反应时间的确定17误区：选择阴性对照不反应的引物误区：选择阴性对照不反应的引物-0.100.10.20.30.40.50.60.70.8020406080100120140TimeTurbidity10^710^610^510^410^310^210^1NC引物选择：①反应时间短；②扩增效率高；③阴性对照出峰时间是阳性最低检出限出峰时间的1.5倍以上。引物选择：①反应时间短；②扩增效率高；③阴性对照出峰时间是阳性最低检出限出峰时间的1.5倍以上。18LAMP方法建立阶段所需的试剂LAMP方法建立阶段所需的试剂•模板DNA•引物FIPF3BIPB3•BstDNA聚合酶•dNTPs•反应缓冲液DNA扩增DNA扩增•模板RNA•引物FIPF3BIPB3•BstDNA聚合酶•逆转录酶•dNTPs•反应缓冲液RNA扩增RNA扩增19LAMP法实验室常规操作步骤LAMP法实验室常规操作步骤DNA/RNA抽取、提纯扩增检测样本1.试剂调配2.样本DNA/RNA添加3.LAMP反应（扩增）4.检测目视检测（荧光）实时浊度检测样本中RNA/DNA的抽取约半小时约1.5小时以内20临床诊断试剂操作步骤临床诊断试剂操作步骤干燥剂型产品，实现了试剂调配过程的简单化；并且使试剂的常温保存成为可能（区别于传统冷冻保存）。核酸提取简单化。例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即可完成抽取步骤。核酸提取简单化。例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即可完成抽取步骤。样品前处理的考虑：样品前处理的考虑：反应液的考虑：反应液的考虑：不仅仅通过实时浊度，荧光・目视法也能进行结果判断。不仅仅通过实时浊度，荧光・目视法也能进行结果判断。。结果判定的考虑：结果判定的考虑：21简易操作过程（以甲型流感为例）提取咽拭子放在抽取液中加入样本用干粉试管加入反应引物颠倒混合5次干粉状试剂（可常温保存）新型A型结果判断目测或浊度仪RT-LAMP反应35分钟提取样本检测完成1小时之内LAMP=快速、简便、高特异、低成本22流感试剂操作简介流感试剂流感试剂操作简介操作简介扩增试剂（反应试管），取出需要的管数（样本＋2）备用试剂准备试剂准备引物溶液新型流感用(H1P)or甲型流感用(FluA)试剂分注试剂分注10μL15μL核酸抽取核酸抽取加样加样LAMPLAMP反应反应z离心后放入仪器z62.5℃35分钟反应判定结果判定结果z观察荧光z通过浊度上升判断添加样品、对照z将引物溶液分注到反应试管中z倒置后静置2分钟，颠倒混合5次添加引物添加引物用采样棉签在抽取试剂重搅拌后，作为样品23小结：小结：扩增反应在等温条件（60～65℃）下连续进行⇒可以使用简便、廉价的扩增装置扩增效率高、可在短时间内完成扩增⇒可在短时间内得出结果有非常高的特异性⇒可得出“扩增反应发生=有目的菌存在”的结论产生大量扩增产物，检测方法简便。⇒无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视方法确认扩增结果从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成⇒可防止由于扩增产物产生的污染。从RNA经一步反应可完成扩增⇒无需另外进行逆转录反应24LAMPLAMP法的应用法的应用25临床领域・病原菌・病毒的检测及鉴定・通过SNP多态性分型决定用药量农业领域・植物病害的早期发现及蔓延防止・转基因作物的检测畜牧业领域・雌雄性别判断・病原微生物的检测・遗传病的发现食品领域・食物中毒致病菌的检测・食品的卫生管理・食物中毒的防止环境领域・环境、水中病原微生物的检测灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征，在各个领域得到广泛应用。工业领域・工业产品用大量DNA的生产成为可能例如例如・・・・・・LAMP法的应用领域LAMPLAMP法的应用领域法的应用领域26LAMP法的应用例（科研）LAMP法的应用例（科研）论文报告（科研・临床对象）•细菌・真菌・寄生虫•结核菌、耐酸菌•肺炎链球菌•支原体•流感嗜血杆菌•百日咳菌•绿脓杆菌（MDR）•MRSA•疟疾•肠毒毒素大肠杆菌•组织侵袭性大肠杆菌（EIEC）•伪膜性结肠炎•Enterococcusfaecalis•口腔细菌（齿周炎病菌）•绿脓杆菌•H.pylori•真菌•病毒zHSVzCMVzVZVzEBVzHHV-6zHHV-7zHHV-8z腮腺炎病毒z麻疹病毒zRSVz日本脑炎病毒z细小病毒B19z风疹病毒z登革热病毒z埃博拉病毒z腺病毒z流感病毒zHPVzHAV•感染症以外应用z胃癌微转移术中快速诊断w（PubMed检索keyword「LAMPisothermalamplification」）进行引物设计，确立进行引物设计，确立LAMPLAMP法检测体系法检测体系→→学会报告、论文发表学会报告、论文发表II.LAMP法について27LAMP法试剂盒产品LAMPLAMP法试剂盒产品法试剂盒产品z★细菌・原生动物z环境卫生检查用zLoopamp军团菌检测试剂盒E（公定法収載）zLoopampクリプトスポリジウム检测试剂盒zLoopampジアルジア检测试剂盒z食品・环境检测用zLoopamp沙门氏菌检测试剂盒zLoopamp肠道出血性大肠杆菌检测试剂盒（公定法収載）zLoopampベロ毒素(VT)タイピング试剂盒zLoopamp大肠杆菌O157检测试剂盒zLoopampL.monocytogenes检测试剂盒zLoopampカンピロバクター检测试剂盒zLoopamp引物组A.acidoterrestriszLoopamp引物组冷水病菌（指針収載）z★病毒zLoopampH5亜型インフルエンザウイルス检测试剂盒（体外診断用医薬品）zLoopampSARS冠状病毒检测试剂盒（体外診断用医薬品）zLoopamp诺如病毒GI检测试剂盒zLoopamp诺路病毒GII检测试剂盒zLoopamp引物组WNVzLoopamp引物组AvianFluH5zLoopamp引物组AvianFluH7zLoopamp引物组KHV（指針収載）zH1pdm2009引物组（干燥剂形用）zFluA引物组（干燥剂形用）z★SNPｓ（单碱基多型）zLoopampP450タイピング试剂盒(CYP2C19＊2)zLoopampP450タイピング试剂盒(CYP2C19＊3)zLoopampP450タイピング试剂盒(CYP2