第十二章-基因工程育种

第十二章基因工程育种第一节概述广义的基因工程育种概念：包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。真正意义的微生物基因工程育种：指的是哪些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或是将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得的新菌种。供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断转基因动物(畜牧业、渔业生物反应器)转基因植物(农业、林业生物反应器)冶金、环保轻工、食品基因工程(geneengineering)常和以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名词时，指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。作动词时，是指基因的分离与重组过程。一、基因工程在微生物育种中的应用（一）通过基因工程方法生产药物1.治疗用药物：如干扰素、胰岛素、白细胞介素等；2.疫苗：甲肝疫苗、乙肝疫苗等；3.单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶等；（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺（四）通过基因工程方法提高菌种抗性（五）构建超级工程菌应用与环境保护二、基因工程原理和步骤基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物或改变物种特性。主要步骤包括：1、目的基因的获得（DNA片段的取得）2、重组体DNA（DNA片段和载体的连接）3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库4、目的基因的表达和重组体的筛选切接转检三、基因工程的研究意义概括地讲，其意义体现在以下三个方面：1.大规模生产生物分子；2.设计构建新物种；3.搜集、分离、鉴定生物信息资源。（一）第四次工业大革命：1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5$上至89$，胰岛素基因表达.1.轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体.2.能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换.3.环保：微生物生态种群.4.信息：蛋白芯片、基因芯片.（二）第二次农业大革命1.生物农药：蛋白类杀虫剂、抗广谱虫害植物；2.农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；3.畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率;4.生物肥料：生物固氮。全球商业化转基因作物的概况◆种植面积：全球转基因作物的种植总面积为4420万公顷◆地区分布：全球主要的种植大国美国、阿根廷、加拿大、澳大利亚的种植面积占全球总面积的99％，其中美国68％、阿根廷23％、加拿大7％、澳大利亚1％，余下的1％为墨西哥、西班牙、法国和南非等国家◆品种分布比例：大豆约占58％，玉米约占23％，棉花约占12％，油菜籽约占6％，其它为1％（三）第二次医学大革命：1.分子病：基因治疗遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症。2.抗衰老：端粒酶编码基因，基因疗法，补充突变基因原始产物、更换突变基因医学方面的应用前景基因制药基因治疗基因诊断基因克隆基因芯片基因工程药物的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/μg红细胞生成素1072元/μg白细胞介素-2410元/μg巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/μg胰岛素10.2元/μg四、基因工程的负面影响◆现代战争狂人、恐怖主义者利用转基因技术制造难以制服的病原体和生物毒剂。◆转基因的超级细菌、病毒一旦从实验室逃逸。给人类带来难以预测的危害。第二节基因工程载体载体：是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体DNA分子，应该具备以下一些基本性质：1.在宿主细胞中具有自主复制和表达的能力；2.能与外来DNA分子片段结合而又不影响本身的复制能力；3.载体本身的分子量要尽可能地小，便于多拷贝，便于与较大的目的基因结合。4.载体上最好有两个以上容易检测的遗传标记；5.载体上应具有2个以上的限制性内切酶的单一切点。一、质粒载体（一）质粒载体的选择标记四环素(tetr)；氨苄青霉素(ampr)；氯霉素(catr)；卡那霉素（kanr）。（二）质粒载体的发展质粒构建的发展趋势主要是调整载体的结构，提高载体的效率。（1）将载体的长度减至最小；（2）增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且使分布更加合理；（3）在质粒中引入多种用途的辅助序列，使它们可以用于以下目的：1.可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体如pUC质粒，可以编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。2.带有单链噬菌体复制起点的质粒载体如M13噬菌体。3.带有噬菌体启动子的质粒载体4.可对重组体进行正选择的质粒载体如编码tetr的质粒载体。（三）常用质粒载体1.pBR322：应用最多。2.pUC18、pUC193.pUC118、pUC1194.pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z5.πAN136.BluescriptM13+、M13－二、λ噬菌体载体噬菌体载体只适合作外源DNA小片段的载体。（一）λ噬菌体载体的特点（二）常用λ噬菌体载体1.λgt112.Charon系列载体三、柯斯质粒载体专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。第三节基因工程所用的酶一、限制性内切核酸酶能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切酶。如EcoRI的切割方式：5'G↓AATTC3'3'CTTAA↑G5'二、DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）3.T4噬菌体DNA聚合酶4.T7噬菌体DNA聚合酶5.Taq噬菌体DNA聚合酶及AmpilTaqTMDNA聚合酶6.反转录酶7.末端转移酶三、依赖于DNA的RNA聚合酶1.SP6噬菌体RNA聚合酶2.T3和T7噬菌体RNA聚合酶四、连接酶、激酶及磷酸酶五、核酸酶1.BAL31核酸酶2.S1核酸酶3.核糖核酸酶A4.核糖核酸酶T15.脱氧核糖核酸酶Ⅰ6.外切核酸酶Ⅲ7.λ噬菌体外切核酸酶第四节基因工程的主要步骤一、DNA的制备（一）质粒DNA的制备1.细菌培养物的生长2.质粒DNA的纯化3.细菌染色体DNA的制备二、目的基因的产生与分离1.聚合酶链式反应：PCR法2.逆转录法：建立cDNA文库3.从基因所在的生物体直接取得：限制性内切核酸酶。4.化学合成法：DNA合成仪。（一）PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA引物4种dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系（1）变性：加热至95℃，使模板DNA解开成单链；（2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸：温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。PCR的基本反应步骤及原理PCR反应的基本原理（三）逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT1、mRNA的纯化：可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。2、互补DNA第一链的合成mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。3、互补DNA第二条链的合成先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。4、互补DNA克隆根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。（三）从基因所在的生物体直接取得鸟枪法（四）化学合成法其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列人工化学合成的限制1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。三、外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接二、克隆载体的选择和构建BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。2.平端连接适用于：（1）限制性内切酶切割产生的平端（2）粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´3´3´5´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT4DNA连接酶15ºC重组体4.人工接头(linker)连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ1.受体菌条件（1）安全宿主菌（2）限制酶和重组酶缺陷（3）处于感受态(competent)四、重组DNA导入受体菌2.导入方式（1）大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（2）高压电穿孔转化大肠杆菌（电转化法）五、重组体的筛选1.直接选择法(1)小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析(2)插入失活法(3)α互补法(4)菌落原位杂交法2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等(1)小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析(插入失活法)（2）、抗药性标记选择（3）α互补的检测X-gal：(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)原位杂交重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环