细胞凋亡实验--ppt课件

细胞凋亡与检测方法汇报人：1ppt课件凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。一、细胞的死亡方式2ppt课件二、细胞坏死与凋亡的比较坏死凋亡性质病理性、非特异性生理性或病理性，特异性诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗能DNA电泳形态变化弥散性降解，电泳呈均一DNA片状细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀DNA片段化（180—200bp），电泳呈“梯”状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应凋亡小体无有基因调控无有3ppt课件三、细胞凋亡的生理意义1.确保正常发育、生长如：指（趾）间隙的形成2.维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞3.发挥防御功能如：使受到病毒感染的细胞凋亡4ppt课件细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化凋亡小体初期：核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小中期：胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割后期：邻近的上皮细胞、MΦ、瘤细胞等吞噬凋亡小体四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变5ppt课件NormalCellApoptoticcell6ppt课件（二）、生化改变１、DNA片段化－主要特征2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活7ppt课件内源性核酸内切酶的作用H1核心颗粒连接区180-200bp内源性核酸内切酶Zn2+Ca2+Mg2+8ppt课件五、细胞凋亡的检测方法1、形态学检测•（一）HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状）•（二）透射电镜观察•（三）荧光显微镜观察9ppt课件透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。10ppt课件荧光显微镜•Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）11ppt课件2、DNA片断化检测•细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成12ppt课件13ppt课件3、流式细胞仪检测flowcytometer•（一）PI单染•（二）Annexinⅴ/PI双染色14ppt课件（一）PI单染•荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。•细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。•乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。15ppt课件•判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）AB16ppt课件（二）Annexinⅴ/PI双染色•原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。•PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。•两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏,•可用PI区分。17ppt课件•检测标准：•早期凋亡细胞：Annexinⅴ-FITC(+)；PI(-)；•坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：•Annexinⅴ-FITC(+)；PI(+)；•机械性坏死及非特异性染色：•Annexinⅴ-FITC(-)；PI(+)；•正常细胞：Annexinⅴ-FITC(-)；PI(-)；18ppt课件C-mycASO200nmol/L凋亡结果坏死结果19ppt课件4、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。20ppt课件•亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590nm）.•JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590nm，线粒体）和绿色荧光（527nm，胞液）.•而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527nm）.•因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.21ppt课件正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.22ppt课件5、Caspase-3活性的检测•Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。23ppt课件Westernblot分析caspase-3的活化Caspase3，6，7Caspase-3正常以酶原(32KD)活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成24ppt课件原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。荧光分光光度计分析活化Caspase-325ppt课件26ppt课件谢谢！27ppt课件