2016年基因导入真核细胞的方法(陈加祥)

基因导入细胞的方法——转化和转染陈加祥[e-mail]一、大肠杆菌的转化（一）大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备（二）感受态细菌的制备步骤（三）大肠杆菌的转化（四）菌落的观察二、细胞转染（一）物理介导（二）化学介导（三）生物介导三、细胞转染分类四、影响转染效率的因素五、转染效率的检测一、大肠杆菌的转化•转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法和CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。宿主细菌含Amp培养基•目前最常用的感受态细胞制备方法为CaCl2法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。•制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%（10%-30%）的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。（一）大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备（氯化钙法）（1）制备感受态所需溶液的配制①液体LB培养基配制分别称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，溶于950mL去离子水，用NaOH调pH至7.0，加去离子水定容至1000mL，高温高压灭菌后，4℃保存。②氯化钙转化试剂配制0.1mol/LCaCl2-MgCl2（感受态制备用）：80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2，去离子水配置，高温高压灭菌后，4℃保存。（二）感受态细菌的制备步骤1、从37℃培养16-20h的新鲜平板中挑取一个DH5α单菌落（直径2-3mm），转到含有100mLLB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3h。2、为得到有效转化，活细胞数不应超过10个/mL，可每隔20-30min测量OD600值来监测培养物的生长情况，待菌液OD600达到0.35时开始收获细菌培养物。3、在无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50mL无菌管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。4、于4℃4100rpm离心10min回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的培养液流尽。5、每50mL初始培养物用30mL预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液重悬，再于4℃以4100rpm离心10min，回收细胞。6、弃上清，将管倒置1min以使最后残留的液体流尽。7、每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2悬浮，即制备成感受态细胞。可即刻使用，也可加甘油保护剂（30%）分装后-70℃保存。临用时冰上解冻。（三）大肠杆菌的转化1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。2、加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。3、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5、将菌液4000rpm离心5min，剩100μl液体混匀后，涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。对照的设置：阴性对照：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。阳性对照：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。请问：为什么要设对照？不设对照行不行？（四）菌落的观察二、细胞转染细胞转染是将外源性基因导入真核细胞内的一种技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。磷酸钙DEAE-葡聚糖脂质体基因导入真核细胞的方法生物粒子导入（基因枪）直接微注射电穿孔物理介导生物体介导化学介导原生质体转染病毒转化方法农杆菌介导法精子介导法1、电穿孔法：电流能够可逆性地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔，促使DNA分子进入胞内的方法。机理：1、电穿孔的攻击引起细胞膜凹陷然后瞬时形成直径波动在2nm至数纳米之间的疏水小孔。2、某些较大的疏水孔变成亲水性的小孔，这是由于穿膜电压增加时形成水性小孔所需的能量小，维持亲水性小孔所需的能量远远小于维持疏水性小孔。（一）物理介导电穿孔操作步骤：MicroPulser电穿孔仪影响电穿孔转染效率的因素：（1）外加电场强度：电压过低不行，过高会杀死大量的细胞。通常250V/cm~750V/cm.（2）电脉冲的长度：20～100ms，由电容量和电转化池的大小决定。（3）温度：室温或0℃效果好。电穿孔前后0℃，然后用温热的培养基稀释铺板。（4）DNA的构象与浓度：线状比超螺旋效率高。浓度：1～40μg/ml（5）培养基的离子成分：用HEPES的buffer比蔗糖的buffer要好。（6）细胞状态：对数期生长的、活跃分裂的细胞培养物转染效果好。优点：转染效率较高。缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。2、显微注射借助显微注射器直接把DNA注入核内，使之整合入受体细胞基因组中。优点：转染效率高，可用于瞬时转染和稳定转染。缺点：导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染。3、基因枪基因枪技术（颗粒轰击）是一种全新的基因导入技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞内的物理方法，是目前国际上较先进的基因导入技术。气体基因枪可在广泛的细胞类型中得到瞬间的稳定和高效率的表达、转化。气体基因枪有一个产生气体冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。基因枪通过用DNA包被的金属粒子在细胞厚壁上打个洞而将DNA进入细胞内或胞内细胞器的方法。高压气体基因枪基因枪转染效率的影响因素基因枪类型和设置:真空度；氦压；枪离靶细胞的距离微载体：一般是钨和金粒子。钨粒子大小不规则，有毒性，易氧化，易导致DNA降解。金粒子大小规则，毒性小。但与DNA结合效率低，价格贵。细胞类型：细菌、植物、动物。不同类型细胞条件不同。细胞生长：密度；生长对数期等。培养基：细菌和植物细胞高渗培养基较好，用甘露醇0.05～1.5mol/L基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。（二）化学介导1、磷酸钙共沉淀法：磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。溶液的准备：2×HEPES（500ml）：NaCl（氯化钠）8.0gNa2HPO4-7H2O（七水磷酸氢二钠）0.198gHEPES6.5gH2Oto500mlpH7.05（用NaOH调节pH值）过滤除菌2MCaCl2（过滤除菌）转染步骤：（1）接种前1d，接种细胞，在转染时细胞汇合度约为80％左右。（2）取一个eppendoff管，依次加入10ug质粒DNA，0.172ml的灭菌水，0.2ml的2×HEPES缓冲液，混合均匀。（3）吸取25ul的2MCaCl2溶液，缓慢的加入到eppendoff管中的混合液中，边加边轻微振动，使加入的CaCl2与混合液混合均匀。（4）加入CaCl2后，静止混合液10分钟，出现轻微云雾状混浊。（5）将混合液加入到培养细胞的平皿中，轻微振荡混匀，将细胞放置在37℃，5％CO2的培养箱中培养。（6）4小时后，镜下观察细胞之间会有沙状颗粒，这是CaCl2颗粒，不用担心。18-24小时后更换培养液。优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１%-５%可以进入细胞核，其中只有不到１%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。重复性不佳；pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。2、脂质体转染法：当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。（1）脂质体的组成：1）磷脂类：包括天然磷脂和合成磷脂二类。磷脂的结构特点为一个磷酸基和一个季铵盐基组成的亲水性基团，以及由两个较长的烃基组成的亲脂性基团。天然磷脂以卵磷脂（磷脂酰胆碱，PC）为主，来源于蛋黄和大豆，显中性。合成磷脂主要有DPPP（二棕榈酰磷脂酰胆碱）、DPPE（二棕榈酰磷脂酰乙醇胺）、DSPC（二硬脂酰磷脂酰胆碱）等，其均属氢化磷脂类，具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点。2）胆固醇：胆固醇与磷脂是共同构成细胞膜和脂质体的基础物质。胆固醇具有调节膜流动性的作用，故可称为脂质体“流动性缓冲剂”。（2）脂质体转染步骤1）转染前一天，接种细胞到直径60mm培养皿中，转染前保持细胞密度为60%-80%；2）在转染前1h更换新鲜的DMEM培养基；3）取10µg质粒DNA，加入注射用生理盐水（或相应的缓冲液）中，至总体积为200μL，轻轻混匀，室温放置；4）取VigoFect转染试剂4μL，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置5min；5）然后将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15min；6）将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入细胞的培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5%CO2培养；7）转染后4-6h去除含转染液的培养液，更换为新鲜的完全培养液；8）继续培养24h后，观察转染效率。（3）转染注意事项细胞转染步骤不是太多，看上去相对比较简单，但如果以下事项没注意，很有可能导致转染效率非常低；1）转染前接种细胞的时间比较重要，一般24h比较合适，如果太短，细胞状态不好，如果太长，则细胞不容易内吞这些转染试剂，从而导致转染效率低；2）细胞接种的密度最好为60-80%；太高或太低，转染效率都会降低；3）在转染前1h更换新鲜的培养基，有利于细胞的生长；4）最好是将转染试剂缓缓加至稀释好的DNA溶液中，而不是将稀释好的DNA溶液加至转染试剂中，顺序不能反。否则不容易形成DNA-脂质体复合体；5）质粒DNA的起始量为10ug，转染试剂的起始量为4ul，但在实际转染时转染效率不是很高，则可以先固定转染试剂的量，逐渐调整DNA的用量；或是先固定DNA的用量，再逐渐调整转染试剂的量，从而找到对你所做的细胞的最适的用