【发酵工艺学总论】第五章-发酵下游技术

2020/12/231——1产物分离提纯技术2020/12/232本部分内容5.1概述5.2发酵液预处理5.3细胞破碎的原理与技术5.4发酵产物的分离纯化原理与技术5.1概述一、下游加工技术的重要性二、下游加工技术的特点三、发酵产物的分类四、发酵产物提纯的步骤和方法五、提取精制过程中应注意的问题六、发酵工程下游加工过程的基本原理七、发酵工程下游加工过程的一般程序一、下游加工技术的重要性a.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。b.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。c.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。5.1概述几种产品在发酵液中的浓度产品典型浓度（g/L）抗生素25氨基酸100酒精100有机酸100酶20蛋白质10二、下游加工技术的特点a.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。b.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。c.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。三、发酵产物的分类从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类：菌体：酶：代谢产物四、发酵产物提炼的步骤和方法影响提炼方法的因素产物类型不同，提取、精制的方法不同。如：分离菌体胞内酶与代谢产物的方法明显不同；产物类型相同，但结构不同，提取精制方法不同。产物酸碱性、水溶性等不同，方法不同。如何着手对一种未知的发酵产品进行提取。(1)产品的类型，性质的研究。①可大致确定它是属于哪一类型；②可了解它是一种成分还是几种成分的混合物。(2)稳定性研究。确定在哪一种条件下进行提取和精制不受破坏，即确定提取条件。发酵产物的提取和精制——浓缩纯化，四个步骤：(1)预处理：改变发酵液物理性质。(2)提取：分离出目的物及其性质相似物。(3)精制：除去相似物，精炼目的。(4)后加工：使用要求决定。常用提取方法：离子交换树脂法膜分离法凝胶层离法沉淀法吸附法溶媒萃取法常用精制方法：除了上述几种外，还含浓缩、结晶、干燥、蒸馏等。其方法的选择：取决于醪特性、菌种、产物性质。五、提取精制过程中要注意的问题：防变性和降解；防辅基流失；防醪中所需产物被分解或挥发；基本原则:快速操作、低温环境、温和条件如pH值选择在目标物质的稳定范围内，尽可能小的剪切作用和防止污染。六、发酵工程下游加工过程的基本原理生物物质的分离方法与一般化学方法虽然有许多不同特点，但在原理上又有许多是相同的根据混合物中不同组分分配率的差异，将其分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中(如溶剂提取、盐析、结晶等)，或将混合物置于某一物相中(主要是液相)，外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域，而达到分离纯化的目的(如电泳、超离心、超滤等)。七、发酵产物提取与精制的一般流程四大阶段：预处理和固液分离阶段、初步提取分离阶段、纯化精致阶段、成品加工阶段5.2发酵液的预处理三、固液分离固液分离是将悬浮液中的固体和液体分离的过程，如将发酵液中的细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质沉淀物等物质分离。常规的固液分离技术主要有过滤和离心分离等。5.3细胞破碎的原理与技术三、破碎率测定1、直接测定：染色、细胞计数2、目的产物测定：与完全破碎率的得率比较。3、导电率测定。四、破碎技术发展1、多种方法结合2、与菌种和发酵过程结合：包涵体的形成、引入噬菌体基因、耐高温产品等。3、与下游分离过程结合。权衡点：高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取5.4发酵产物的分离纯化原理与技术一、沉淀分离技术二、萃取分离技术三、吸附分离技术四、膜分离技术五、离子交换分离技术六、层析分离技术七、成品加工2020/12/2325沉淀是指溶液中的溶质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。分离过程中采用沉淀技术，其目的有两个：一是通过沉淀使目标成分达到浓缩和去除杂质的目的；二是通过沉淀可将已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。一、沉淀分离技术5.4发酵产物的分离纯化原理与技术当盐浓度增加到一定程度时，在盐离子的作用下，水活度大大降低，同时蛋白质表面的电荷被大量中和，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而相互聚集；而且，中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而破坏蛋白质分子外表的水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用而使蛋白沉淀析出，即盐析。1、盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、醋酸钠、硫氰化钾等。在蛋白质的盐析中，以硫酸铵应用最广。盐析的操作：pH蛋白质、酶等经过盐析沉淀分离后，产品夹带有盐分，需脱盐处理。常用的方法有透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。与无机沉淀剂相比，有机沉淀剂的优点在于：（1）选择性比较高，即一定浓度的有机沉淀剂只沉淀分离某一种或某一类溶质组分；（2）沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发而易于去除。有机沉淀剂的缺点是对有些生物大分子如酶类有失活作用，因而常需在低温下操作。2、有机溶剂沉淀分离法机理：（1）有机溶剂改变了溶液的介电常数。加入有机溶剂后，降低了溶液介电常数，因而增强了溶质分子间的静电作用力，降低了溶质分子与溶剂分子间的相互作用，导致溶质分子间发生聚合而析出。（2）脱水作用。由于有机溶剂必须溶解在水溶液中，这样就减少了溶质与水的作用，因而使溶质脱水而相互聚集沉淀。3、等电点沉淀法4、变性沉淀分离法加热、加有机酸、调pH二、萃取分离技术利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。1、有机溶剂萃取物理萃取即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。化学萃取则利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配，萃取剂与溶质间的化学反应包括离子交换和络合反应等。2、双水相萃取溶剂萃取法，一般是将水溶液中的溶质萃取到有机溶剂中，这会使许多生物大分子在有机溶剂中失活变性。双水相系统中多聚物的水溶液给生物分子提供温和的环境。双水相萃取可直接从细胞破碎匀浆中萃取蛋白质，无需分离细胞碎片。2020/12/23353、反胶束提取纯化技术将表面活性剂溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体即为反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内，形成一个极性的核，此极性核可以溶解极性物质（水溶液）。形成含生物大分子的反胶团的常用方法有：（1）相转移法通过将含生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢地搅拌，在形成反胶团的同时，其中的生物大分子即转入到反胶团中。（2）注入法通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。（3）溶解法对于固体粉末中含有的生物大分子，可采用溶解法。先制备好含水的反胶束的有机溶液，然后把含生物大分子的固体粉末加进此种反胶束的有机溶液中，同时搅拌，生物大分子慢慢地进入到反胶束内的水中心而实现萃取过程。4、超临界萃取技术超临界萃取是以超临界流体作为萃取剂，在临界温度和临界压力附近的条件状态下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分，又称为压力液体萃取、超临界气体萃取等。三、吸附分离技术吸附是溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附分离法是利用不同组分（溶质）在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异进行分离的方法。吸附剂一般为多孔微粒，具有很大的比表面积。四、膜分离技术1、膜分离技术原理用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法，统称为膜分离法2、膜分离技术的特点膜分离技术一般在常温下操作，不需加热，被分离的物质能保持原来的性质，能保持生物物质的活性。其选择性强，操作过程简单，适用范围广。膜分离技术在分离物质过程中不涉及相变，无二次污染。可分批或连续操作，易于自动化和扩大生产规模，分离效率高。其缺点是：膜易污染而使其性能降低，合成材料制成的膜在耐热、耐化学腐蚀等方面不理想。3、微滤一般采用深度过滤膜作预过滤，再用微孔滤膜精确分离大小不同的各种颗粒或细菌。深度过滤膜是由不规则放置的纤维构成的网状孔道而形成的滤网，用于去除过滤液中的粗大颗粒杂质以保护后续的微滤膜。微孔滤膜是一组由多层的网状小孔紧密连接而成的薄片，每层的网孔均有一定的孔径，孔径的大小由产品的性能而定，滤膜的孔径从0.45um到0.2um、0.1um。4、超滤所谓超滤，就是在一定压力（0.1-1MPa）下将溶液通过孔径非常小（50-10000Å）的滤膜，使溶液中溶剂、无机盐和小分子物质透过薄膜，而截留溶液中的悬浮物、胶体、微生物等大分子物质，从而达到液体净化、分离与浓缩的目的。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起组成的。超滤过程与反渗透过程非常接近，只是超滤膜孔径稍大，而反渗透操作压力较高。5、反渗透原理：当把相同体积的稀溶液和浓液分别置于一容器的两侧，中间用半透膜阻隔，稀溶液中的溶剂将自然的穿过半透膜，向浓溶液侧流动，浓溶液侧的液面会比稀溶液的液面高出一定高度，形成一个压力差，达到渗透平衡状态，此种压力差即为渗透压。若在浓溶液侧施加一个大于渗透压的压力时，浓溶液中的溶剂会向稀溶液流动，此种溶剂的流动方向与原来渗透的方向相反，这一过程称为反渗透。五、离子交换分离技术离子交换分离法是利用溶液中的溶质离子与离子交换树脂的活性离子交换时结合力大小不同而进行分离的一类方法，在发酵工程中，离子交换法广泛应用于水的处理和小分子产物如氨基酸、有机酸的提取。2020/12/23481、离子交换树脂的类型离子交换树脂由不溶性的高分子聚合物骨架、功能基团和活性离子三部分组成。在水溶液中，树脂的活性离子可从功能基团上解离下来，在骨架与溶液间自由迁移，并可与溶液中的同性离子发生离子交换作用。若活性离子为阳离子，可与溶液中的其他阳离子发生交换，则这类树脂称为阳离子交换树脂；若活性离子为阴离子，可与溶液中的其他阴离子发生交换，则这类树脂称为阴离子交换树脂。（1）强酸性阳离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂含有磺酸基-SO3H等强酸性官能团，由于强酸性阳离子交换树脂的离解能力很强，其离解程度不随外界溶液的pH的大小而变化，因此使用时pH没有限制。此外，以磷酸基-PO(OH)2和次磷酸基-PHO(OH)作为活性基团的树脂具有中等强度的酸性。（2）弱酸性阳离子交换树脂弱酸性阳离子交换树脂一般含有-COOH、-OH等弱酸性官能团，电离程度小，其离解和交换性能与溶液pH有很大的关系。在溶液pH较低时，几乎不会发生离子交换作用，只有在碱性、中性或微酸性溶液中才能进行离解和离子交换。使用时R-COOH应在pH6的溶液中操作，R-OH应在pH9的溶液中操作。（3）强碱性阴离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂含有季胺基（NR3OH）等强碱性基团，离解性强，使用时不受溶液pH限制。（4）弱碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂含有伯胺基、仲胺基、叔胺基或吡啶基等弱碱性基团，离解能力较弱，只能在较低pH下进行离子交换操作。2、离子交换树脂的理化性能（1）颗粒度（2）交联度交联度的大小决定着树脂的网状结构的疏密和机械强度，同时交联度的变化还可使树脂对大小不同的各种离子具有选择性通过的能力。交联度不易测准，故常用与之有关的深胀水和膨胀系数来表征。（3）孔度、孔径、比表面积孔度是指每单位质量或体积树脂所含有的孔隙体积；孔径大小对离子交换树脂的选择性影响很大，凝胶树脂的孔径决定于交联度；比表面积与树脂的吸附量和交换速度有关。（4）交换容量交换容量是表征树脂性能的重要参数，它反映树脂与溶液中离子进行交换的能力。交换容量通常以单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数表示，可用酸碱滴定法测定。3、树脂和操作条件的选择选择合适的树脂是应用离子交换法分离物质的关键。选择时首先要考虑待分离物质的荷电性质，若在其稳定的pH下带正电荷，选用阳离子交换树脂；带负电荷则选择阴离子交换树脂。其次要兼