生物化学电子教程

§2.7酶的作用机理及实例1.底物和酶的靠近(proximity)与定向(orientation)在化学反应中，反应速度与反应物的浓度成正比，若在酶促反应系统中的催化场所—酶的活性中心，增加底物浓度，反应速度也会随之增加。酶促反应加速的原因之一，就是使底物分子集中于酶的活性中心，大大提高这个区域底物的有效浓度，从而加速酶促反应速度。曾测过某酶促反应中，溶液中的底物浓度为0.001mol/L,而在活性中心的底物浓度竟达到10mol/L，比溶液中高出一万倍！因此在酶活性中心区域的高底物浓度决定了高的反应速度。一.决定酶高效率催化的机制仅仅是靠近还不够，还需要酶和底物的反应基团在反应中彼此相互严格地定向，即酶活性中心的催化基团(氨基酸残基上的基团)定向于底物的反应基团。只有既靠近又定向，底物分子才能迅速的形成过渡态，加速反应的进行。靠近与定向A.酶的催化基团和底物的反应基团既不靠近，也不定向。B.两个基团靠近，但不定向，不利于反应进行。C.两个基团既靠近，又定向，有利于反应进行。2.底物变形(distortion)与电子张力(electronstrain)酶与底物结合后，底物发生变形，底物由基态变为激发态，降低了活化能，使酶促反应加速。酶与底物结合后，底物发生形变。酶与底物结合后，酶分子中的某些基团或离子可以使底物敏感键中的某些基团的电子云密度增加或降低，从而产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反应。3.共价催化(covalentcatalysis)共价催化的一般形式是酶活性中心上的亲核基团对底物的亲电子基团进行攻击，二者形成共价键，这个共价中间物很容易变成过渡态，反应的活化能大大降低，反应速度加快。酶分子上的亲核基团有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。蛋白质中三种主要的亲核基团4.酸碱催化(acid-basecatalysis)共价催化也可以是酶的亲电基团对底物的亲核基团进行攻击，酶分子上带正电的基团有H+、Mg2+、Fe3+—NH3+等，它们攻击底物分子上带负电的亲核基团，与底物形成共价键,进行催化。酶活性中心的一些基团作为质子的供体或质子的受体对底物进行广义的酸碱催化。组氨酸的咪唑基是酶催化反应中的最有效、最活泼的催化功能基团。咪唑基的pk=6.0,在生理pH条件下，有一半以酸性形式存在，另一半以碱性形式存在，因此既可以作质子的供体又可以作质子的受体，在酶促反应中发挥作用。广义酸基团（质子供体）广义碱基团（质子受体）COOHCOO-NH3+NH2¨OHO-SHS-CCHNHN+HCHCCHNHN∶CH蛋白质中作为广义酸碱催化的功能基团5.微环境效应酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，削弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反应的进行。例如：酶活性中心的羧基与水形成氢键，导致酶活性中心羧基表面有一层水化层，水分子的屏蔽作用，大大削弱了酶分子与底物离子间的静电相互引力，不利于酶促反应。二.溶菌酶（lysozyme)溶菌酶存在于鸡蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。1.底物、溶菌酶及酶和底物复合物的结构•溶菌酶的底物溶菌酶通过水解某些细菌细胞壁的多糖组份来溶解细胞壁，细胞壁的多糖由两种糖组成:N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)溶菌酶的最适小分子底物NAG和NAM交替排列形成多聚物，它们之间通过β-1,4糖苷键相连。溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替形成的六糖。6个糖环分别用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键。•溶菌酶的结构溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键。活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52。鸡蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列•溶菌酶和底物结合的空间构象从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的凹穴。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合，凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基。溶菌酶----底物复合物2.催化作用机理•溶菌酶底物与酶活性中心的关系溶菌酶活性中心上的Asp52氧原子距离底物敏感键(C-O键)中碳原子（D糖环氧原子）只有0.3nm，活性中心上另一个氨基酸Glu35的羧基距离底物敏感键(C-O键)中氧原子也只有0.3nm，溶菌酶的活性中心的氨基酸残基与底物敏感键既靠近又定向。•底物D糖环构象发生变化C3C4C5C2C1OC3C4C5C2C1O溶菌酶底物D糖环变形模型图椅式：C5、C1、C2和O不在同一平面C3C4C5C2C1OC5向前移动，O原子向后移动半椅式：C5、C1、C2和O在同一平面上酶与底物结合后，D糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。•酸碱催化酶活性中心的Glu35处于非极性区，其羧基呈不解离状态，而Asp52处于极性区，羧基呈解离状态。Glu35COC1C4HOEOH(NAG)NAGOOHOCO-Asp52Asp52-COOONAGDHOEOHC4C1OCGlu35-HOH-+H2O+H非极性区极性区(NAG)O33Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1带上正电荷成为正碳离子。Asp52上的-COO-起着协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用。DGlu35COOHOC1HOHD(NAG)3OCO-Asp52最后，来自环境中的水分子上的H+与Glu35的-COO-结合，水分子上的HO-与正碳离子结合，至此，一次反应完成，细胞壁打开一个缺口。经多次重复作用，细菌的细胞壁溶解。3.溶菌酶催化特点小结靠近与定向底物形变酸碱催化（二）胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin)胰凝乳蛋白酶是由241个氨基酸组成，分子量为25000，分子呈椭圆状，含α-螺旋较少。活性部位由Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成，这三个氨基酸残基形成催化三联体。催化三联体：催化机理：酶活性中心的三个氨基酸底物His57作为质子的受体从Ser195吸取一个质子，形成共价键，使Ser195-O-成为很强的亲核试剂，攻击底物羰基碳原子，二者形成共价键。电子云向底物羰基氧原子转移第一步第二步底物-NH上的电子云向酶分子的His57-N+H转移，His57作为酸向底物提供质子。底物的C-N键断裂第三步底物C-N键氮端产物释放第四步第五步水分子的-OH亲核攻击底物羰基碳原子,形成共价键。His57作为质子的受体从水分子上接受质子。第六步底物C-O-的电子云向His57-N+H转移,Ser195的氧与底物的碳之间的共价键断开。Ser195作为质子的受体从His57接受质子，酶恢复原状。第七步第八步胰凝乳蛋白酶催化机制的特点：广义的酸碱催化共价催化丝氨酸蛋白酶（serineproteases）丝氨酸蛋白酶是一类最有特色的酶家族，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶等。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道，在消化道中转化成有活性的酶。这三种酶在一级结构上有40%的氨基酸顺序是相同的，三维结构也很相似，都有Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成的催化三联体，它们的催化作用机理也相似，但它们的专一性是完全不同的。这三种酶的活性部位位于分子表面的凹陷区域，这个凹陷结构区域称为口袋。由于三种蛋白酶的口袋的差异造成它们的专一性不同。胰凝乳蛋白酶的口袋底部有一个小的Ser，口袋上方有两个小的Gly残基，有利于较大的芳香族氨基酸侧链进入，因此胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸形成的肽键。胰蛋白酶口袋底部有一个带负电荷的Asp，有利于结合带正电荷的Arg、Lys残基，决定了胰蛋白酶可以催化精氨酸和赖氨酸羧基形成的肽键。弹性蛋白酶有一个浅的口袋，口袋上方有大的Thr和Val残基，只允许小分子的氨基酸像甘氨酸、丙氨酸进入，因此弹性蛋白酶可催化甘氨酸和丙氨酸羧基形成的肽键。§2.8酶原激活有些酶在体内合成出来即可自发的折叠成一定的三级结构，酶就立刻表现出酶活性，如溶菌酶。有些酶在体内合成出来的只是它的无活性的前体，经过蛋白酶的催化作用，构象发生变化，才能变成有活性的酶。该活化过程，是生物体内的一种调控机制。这种调控机制的特点：由无活性的酶原转变成有活性的酶是不可逆转的。一.胰蛋白酶原的激活二.胰凝乳蛋白酶原的激活三、几种蛋白酶的激活及它们之间的相互作用弹性蛋白酶胰蛋白酶原六肽＋胰蛋白酶自身催化肠激酶羧肽酶原羧肽酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原§2.7寡聚酶、同功酶、诱导酶、固定化酶一、寡聚酶寡聚酶是由两个或多个亚基组成的酶。二、同功酶同功酶是指能催化同一化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成都有所不同的一组酶，它们的Km和Vm各不相同。如：哺乳动物中有五中乳酸脱氢酶，它们催化同一反应，分子量相近，但氨基酸组成及顺序不同，可用电泳法得到。三、诱导酶•根据诱导酶合成与代谢物的关系。人们把酶相对地区分为结构酶和诱导酶。•结构酶是指细胞内天然存在的酶，它的含量稳定，受外界的影响小。•诱导酶是指当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶。它的含量在诱导物存在下显著增高。这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。•诱导酶或许是细胞中本身就存在，但含量低，当加入诱导物后显著增高；或许是细胞中不存在这种酶，当加入诱导物后诱导产生。四、固定化酶•把水溶性的酶固定在一固相的载体上，很容易从反应液里分离出来，可以反复使用，比较经济。•固定化酶稳定性高，有利于储藏保存，有一定机械强度，可用于工厂的连续自动化生产。•固定化酶弥补了水溶性酶的很多缺点。如：不能反复利用，不易于产物分离，不利于产品的提纯精制，成本高。近年来，固定化酶发展相当迅速，许多酶已实现工业化生产。自己看的内容•羧肽酶A的作用机理•多酶体系•调节酶别构酶别构效应反馈作用共价调节酶共价调节的磷酸化酶的特点GoHome