微生物农药—细菌PPT演示课件

第二章微生物农药1微生物可分为：1、无细胞结构的：真病毒、亚病毒；2、具有原核细胞结构的：真细菌（细菌、放线菌、蓝细菌、立克次氏体、支原体、衣原体）、古细菌；3、具有真核细胞结构的：真菌（酵母菌、霉菌）、单细胞藻类、原生动物等。2微生物农药是指应用生物活体（包括细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫或基因修饰的微生物）制成的防治作物病、虫、草、鼠等有害生物的制剂，也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂。微生物农药是目前生物农药的一个最主要的组成部分，其基础研究和产业化研究均走在整个生物农药研究领域的前列。3按微生物种类分类：细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌真菌类：白僵菌、绿僵菌病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫微孢子原虫类4用于制备生物农药的主要微生物类群生物类别致病生活阶段及传播作用方式适用环境形成孢子的细菌杀虫剂晶体毒素，抗性强的孢子胃毒，侵染植物表面，水，土壤原生动物杀虫剂抗性强的孢子中肠侵染植物表面昆虫病毒抗性强的包涵体中肠侵染植物表面枝霉菌素杀虫剂相对弱或抗性强的孢子接触侵染土壤、植物表面，水、昆虫表皮霉菌除草剂相对弱的孢子接触侵染土壤、植物表面细菌除草剂弱的细菌细胞，抵抗力强的孢子接触侵染土壤、植物表面拮抗植物病原菌的真菌、细菌抗性强的或弱的孢子接触侵染或抑制土壤、植物表面细菌真菌共生体细菌，传播能力弱接触侵染土壤嗜虫线虫传染阶段（相关的细菌），传播能力弱寻找寄主后侵染土壤、水5第一节细菌农药电子显微镜下的细菌三型球菌杆菌螺旋菌6细胞壁细胞膜夹膜细胞质DNA鞭毛细菌的结构模式图7染色法革兰氏染色Gramstain：由丹麦细菌学家革兰(HansChristianGram)创建的一种鉴别染色法。采用4种试剂分4步：结晶紫碘液95%乙醇复红（初染）（媒染）（脱色）（复染）革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌（菌体为紫色）（菌体为红色）8革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌9有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。10细菌农药按用途分细菌杀虫剂细菌杀菌剂细菌杀鼠剂微生态制剂芽孢杆菌类非芽孢杆菌类按是否产芽孢分细菌农药的分类细菌杀线虫剂11一、细菌性杀虫剂蜡状芽孢杆菌杆状菌假单孢菌链球菌12昆虫疾病：非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理失调及先天性不足。传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫、立次克体。13具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于3个科：芽孢杆菌科（Bacillaceae）、肠杆菌科（Enterobacillaceae）、假单胞菌科（Pseudomonodaceae）。其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的2个属：芽孢杆菌属（Bacillus）梭状芽孢杆菌属（Clostridium）。141、细菌性杀虫剂的特性(1)细菌属于原核生物，单细胞的有机体，个体较小，一般体长都在微米级，缺乏完整的细胞核，有的可以运动，有些种在有氧和无氧的条件下都能生存。多数以二分裂法进行无性生殖，有些也可以进行有性生殖。许多细菌具有质粒可以把基因导入菌体中。15(2)大多数的昆虫病原细菌是通过口和消化道感染昆虫的，只有少数通过卵、体壁和气管感染。细菌也可以通过寄生虫和捕食昆虫携带感染。16(3)细菌繁殖速度极快，种类繁多，广泛分布在自然界中，因此其与昆虫接触的机会很多，容易感染昆虫。昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如活动缓慢，食欲减退，腹泻和呕吐等。大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起败血病导致昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐色和黑色，虫体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带有臭味的黏稠液体。17(4)在昆虫病原菌中，有寄主范围很窄的专性病原细菌和寄主范围很宽的兼性病原细菌。专性细菌一般在合成培养基上不能生长，对特定的昆虫具有很强的致病力；兼性细菌在培养基上能生长，具有易繁殖、易生产等特点，是微生物农药的主要病原菌。目前应用较广的专性病原细菌有日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌，兼性病原细菌有芽孢杆菌属和沙雷铁杆菌属。18(5)细菌杀虫剂有独特的作用方式和杀虫机理，通过营养体、芽孢在体内繁殖并产生生物活性蛋白、毒素等杀死目标昆虫。具有很高的选择性和很少的交互抗性。19(6)实际应用的部分细菌农药的缺点1)杀虫谱比较窄2)不具内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫3)作用速度比较慢4)生产工艺比较复杂5)持效期比较短，受日光照射容易失效等，从而影响了该类农药的发展。201901年，石渡繁胤(Ishiwata)，生病的蚕蛾。1911年，Berliner在德国苏云金地区的面粉厂里的地中海粉螟中分离出Bt，并于1915年首次对其命名。20世纪20年代中期，才首次用Bt对鳞翅目幼虫(欧洲玉米螟)进行了田间药效试验，引起了当时许多昆虫学家的注意。1938年法Sporeine第一个商品制剂。1953.Hannay伴孢晶体杀虫作用1971.日本农林省解除禁令，植保局成立Bt研究会相继发现了对鞘翅目，螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫，动植物寄生线虫，鞭毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的Bt菌株。1、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)21中国：1940年代：用苏云金杆菌防治菜粉蝶（中大蒲蛰龙）1950年代：从法国引进苏云金杆菌1964年，湖北和湖南两省设厂生产1970年代初，大规模群众性生产1980年代后：“七五”“九五”“十五”攻关，863，2010年中长期规划:资源调查、生产工艺改进、质量标准化、蛋白基因克隆、转BT基因植物。22(1)Bt形态特征及生理生化1)形态特征：3个阶段营养体：杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。芽孢囊：菌体老熟时，一端斜生一个椭圆形芽孢，另一端同时出现伴孢晶体。晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形，通常1个，也有几个毒素主成分，但亦有发现对昆虫无毒。芽孢和伴孢晶体的释放：芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。23苏云金芽孢杆菌的特征24VegetativecellofBacillusthuringiensis25细菌的芽孢类型苏云金芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体26CrystaldiversityofB.thuringiensis27晶体毒素蛋白晶体蛋白空间结构28SporeandparasporalcrystalsporeCrystal292)生理生化Bt对营养条件要求不高。所需主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种N源，碳源和无机盐中正常发育。通常所利用的营养:碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、直接为Bt吸收利用N源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆等。30无机盐：K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙6种，微量元素的锰、锌、硅、铁等，微量元素所需甚微，水中含的微量无素即可满足，多了有毒。温度：10-40℃都能生长，以28-32℃较适。35-40℃生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。因此在一定范围内提高温度会缩短生长期，但菌数量会降低；而温度低则生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。31pH：与其他细菌类似，该菌适于微碱性条件，最适pH是7.5，当pH达8.5时还能形成芽孢，如pH降至5以下则不能形成芽孢。氧:是一种好氧细菌，需要充足的空气才能生长发育良好。尤其当芽孢形成时，若缺乏足够的空气时会延迟芽孢的形成或不能形成。它还影响到生长速度、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。32紫外线:阳光对芽孢有致死作用。芽孢暴露在紫外光下很快失活:1分钟失活12%、2分钟50%失活、10分钟99%失活。在自然阳光下，30分钟50%失活，60分钟80%失活。在290-400nm处死亡率最高。抗生素及化学物:放线菌素、氯霉素、红霉素及一些化学物质都有影响。乳化剂对芽孢萌发有抑制作用，TritonX-100在100μg/ml时，全部抑制了芽孢萌发。33(2)分类、命名及来源1)分类苏云金杆菌亚种在生物化学、血清学、孢子体、抗原、抗生素的合成、酶、噬菌体和外原凝集素组成等方面都有差异。Krieg等人在1983年提出了一种非常简单的利用致病类型对细菌类微生物杀虫剂进行分类的方法，虽然这种方法不太适合Bt（例如，许多亚种产生的毒素涵盖了多种不同致病型），但是对于Bt商品化产品来说是一种比较适合的分类方式。34致病型A:包括对鳞翅目的致病菌（BTS在美国已注册应用于50多种蔬菜、30多种水果、30种田间谷物、15种牧草及香料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心虫等）另外有些公司利用遗传工程技术使得Bt菌寄主范围扩大，并且延长了其在田间的存活时间。同时利用融合两个不同株系发展出一些新产品，甚至新的株系。35致病型B:包括对双翅目的致病菌（以色列亚种，首先在美国注册，已在全球范围内作为控制蚊虫和蚋的人工合成有机杀虫剂的替代品使用。在德国广泛用于控制当地的顽固性公共卫生害虫——伊蚊，该菌同时也被WHO和UN纳入到其蚊虫控制计划中。作用机理都为芽孢中的四个主要活性蛋白起作用）36致病型C:则主要包括对鞘翅目的致病菌（日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，对鞘翅目害虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或单独的作用）。372)鉴定种以下可按鞭毛抗原、生理生化，酯酶电泳分为变种(var.)或亚种(subsp.)，现在已有60多个血清型80多个亚种。38生理生化:细菌、病毒常用对生理生化反应的正负和强弱来区分。Bt可利用各亚种间生理生化上的差异，如对碳源和氮源的利用及某些酶类和代谢产物的有无来区分。这种方法简便易行常用，但亲缘较近的变种之间差别往往很小，容易导致错误。39酯酶电泳:比一般生化反应具有较高的特异性，实验条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。PCR技术用于Bt基因分类40H抗原:H为德语Hauch(扩散)之意，不同亚种抗原分析的血清学反应则具有较高的鉴别能力，是利用细菌或其某一部分构造具有的特异性抗原注射动物体内，促使动物血清中产生和抗原起作用的抗体，抗体存在于动物血清中，利用已知的抗血清可以检定未知的菌种。抗原和抗体可以发生多种不同的作用，常用凝集反应。根据未知菌种和已知抗血清在试管中有无凝集现象便可判别此菌是否为与抗血清相应的菌种。Bt鞭毛具有这种特异抗原性，能用血清方法加以鉴别。41苏云金杆菌的分类方式423)命名苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据四条:根据采集地:如苏云金亚种、肯尼亚亚种、加拿大亚种、以色列亚种、九州亚种、东北亚种(九州和东北为日本省名)、云南亚种、武汉亚种、华中亚种、山东亚种等。根据寄主虫名:如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。根据分离者名字：如Kurstak、Thompson、Morrison等。根据病症进行命名：如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种等。434)苏云金芽胞杆菌的来源与分离Martin等1990年在澳洲Adelaide举行的第五届ICIP会议上，统计了Bt菌株的分离情况：22%来于昆虫体、44%来源于土壤，18%来自贮藏物，其他(粉尘、植物等)占16%。地理区域：目前除南极洲未见报道外，其他地区均有发现BT。在海拔近4英里的高处几乎没有昆虫生存，而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的Bt菌种。44存在环境：昆虫：许多Bt分离自蚕(场)等饲养昆虫体上。贮藏产品：第一株正式命名的Bt分离于德国苏云金地区面粉厂的地中海粉螟上。植物体表面：近年来随着研究的不断深入，发现植物体表面亦存在Bt。45土壤：土壤是微生物的大本营，苏云金芽胞杆菌是一种土壤习居菌。Martin和Travers从土壤中找到新的Bt菌种，这一事实改变了Bt菌的历史。因为起初科学家们认为，只有找到死昆虫才能找到这些细菌。本来以为它是一种昆虫病，但实践证明，Bt实际上是多种土壤中的正常组