DNA的生物合成总结

DNA的生物合成DNABiosynthesis，Replication本章重点与难点重点：掌握中心法则；半保留复制、半不连续复制、反转录、基因工程的概念；参与DNA复制的有关酶类和蛋白质及DNA的复制过程；DNA损伤修复的方式。难点：对DNA的半保留复制、半不连续复制的理解。复制（DDDP）转录（DDRP）翻译DNAmRNA蛋白质反转录（RDDP）RNA复制（RDRP）DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代（母链）DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA一、DNA复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)（一）DNA复制是半保留复制(semi-conservativereplication)DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。•半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从原点(起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。（二）DNA复制是固定起点的双向复制复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个复制原点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是能够独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’（三）DNA复制是半不连续复制3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)•顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为先导链或领头链。•另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随后链或随从链。复制中的不连续片段（约1000个核苷酸）称为岡崎片段(okazakifragment，1968)。•先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复制或复制的半不连续性。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。（四）需要引物参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。二、DNA复制的酶学（DNA复制相关的酶和蛋白质）TheEnzymologyofDNAReplication•参与DNA复制的物质底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DDDP或DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子•聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。新链的延长只可沿5→3方向进行（模板方向为3→5，合成方向为5→3。）（二）DNA聚合酶全称：DNA依赖的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´•35外切酶活性•53外切酶活性?能切除突变的DNA片段和RNA引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。•核酸外切酶活性目录1、原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数+-+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-polⅡ（120kD）•DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。•它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-polⅢ：由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。(250kD)2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol真核生物的DNA聚合酶填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，参与染色体DNA复制的是polα（延长随从链）和polδ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。（三）复制保真性的酶学依据•复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。•复制保真性的酶学机制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读复制的保真性和碱基选择1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。2、复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制（四）复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。1、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质•解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链•引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶•单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。解螺旋酶（unwindingenzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。108局部解链后2、DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)解链过程中正超螺旋的形成目录•拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ•分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。•作用机制目录（五）DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。•DNA连接酶(DNAligase)作用方式POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。•DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。•在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。•也是基因工程的重要工具酶之一。•功能三、DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication1、复制的起始需要解决两个问题：1）DNA解开成单链，提供模板。2）合成引物，提供3-OH末端。（一）原核生物的DNA生物合成E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GAT