试验八血糖的测定葡萄糖氧化酶法

实验十血糖的测定血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定，维持在3．9mmol／L～6．1mmol／L之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义：其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二，保证机体不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同，大致分三类：氧化还原法，缩合法（主要有邻甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。下边介绍两种方法供选择。一、葡萄糖氧化酶法【目的】1.了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理，能进行血糖测定的操作。2.掌握血糖测定的临床意义。【原理】葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶(peroxidase，POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，即Trinder反应。其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在505nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下：2H2O2+4-氨基安替比林+酚红色醌类化合物POD2H2O2H2O2O2葡萄糖+葡萄糖酸+GOD+【器材】试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计【试剂】1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠（或1mol/L盐酸）调节pH至7.0，然后用蒸馏水稀释至1L。2.酶试剂称取过氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中，用1mol/LNaOH调pH至7.0，加磷酸缓冲液至100ml。置冰箱保存，4℃可稳定3个月。3.酚溶液称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L的溶液，贮存于棕色瓶中，用时稀释），用棕色瓶贮存。4.酶酚混合试剂取上述酶试剂与酚溶液等量混合，4℃可以存放一个月。5.12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至1L。6．葡萄糖标准贮存液（100mmol/L）称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，并移入100ml容量瓶内，再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。7.葡萄糖标准应用液（5mmol/L）吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml于100ml容量瓶中，加12mmol/L苯甲酸溶液至刻度。【操作】取3支试管,编号，按下表操作。表3-12血糖测定操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清－－0.02葡萄糖标准液－0.02－蒸馏水0.02－－酶酚混合液3.03.03.0混匀，置37℃水浴中保温15分钟，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】测定管吸光度血糖（mmol/L）=×5标准管吸光度血清葡萄糖（mmol/L)＝标准管吸光度测定管吸光度×5【注意事项】1．测定结果如超过20mmol／L，应将标本用生理盐水稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。2．若酶酚混合试剂呈红色，应弃之重配。因标本和标准用量少，其加量是否准确对测定结果影响较大，故其加量必须准确。3．GOD-POD法的第一步反应特异性高，而由POD催化的第二步指示反应是非特异性的，易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰，这些物质与色素原竞争H202，使测定结果偏低。4．Trinder反应由Trinder于1969年提出。后经许多学者改进，采用2，4-二氯酚、2-羟-3，5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚，使反应灵敏度得以提高。【正常参考范围】3.9～6.1mmol/L【临床意义】1.生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后，或精神紧张、交感神经兴奋，肾上腺分泌增加时。2.病理性高血糖⑴糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。⑵对抗胰岛素的激素分泌过多：如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α-细胞瘤等。⑶颅内压增高：颅内压增高（如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等）刺激血糖中枢，出现高血糖。⑷脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3.生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。4.病理性低血糖⑴胰岛素分泌过多：由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。⑵对抗胰岛素的激素分泌不足：如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。⑶严重肝病患者：肝贮存糖原及糖异生功能低下，不能有效调节血糖。【结果及分析】【思考题】1.血糖有哪些来源和去路，机体是如何调节血糖浓度恒定的？2.酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制，用蒸馏水是否可以，为什么？二、邻甲苯胺法【目的】了解测定血糖的原理和方法，要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。【原理】葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水生成雪夫（Schiff）碱，再经结构重排，生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下：葡萄糖+邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱【器材】试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计【试剂】1．邻甲苯胺试剂于940ml冰醋酸中加入硫脲1.5g,邻甲苯胺60ml,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色试剂瓶中,室温保存。新配试剂应放置24小时后（待老化）使用。此试剂腐蚀性强，避免接触皮肤，应用自动吸管加液。2．12mmol/L苯甲酸溶液于900ml蒸馏水中加入苯甲酸1.4g,加热助溶,冷却后置于1L容量瓶中,加蒸馏水至刻度。3．葡萄糖标准储存液（100mmol/L）称取无水葡萄糖（预先置80℃烤箱干燥至恒重，移置干燥器内保存）1.802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中,移置100ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。4．葡萄糖标准应用液（5mmol/L）取葡萄糖标准储备液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。【操作】1．取16×150mm试管3支按下表进行操作：-H2O表3-13血糖测定操作步骤试剂（ml）测定管标准管空白管血清或血浆0.1——葡萄糖标准应用液—0.1—蒸馏水——0.1邻甲苯胺试剂3.03.03.02．将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟，取出用自来水冷却5分钟。注意在煮沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。否则则温度不均而影响比色。3．用波长630nm分光光度计进行比色，空白管调零点，读取测定管与标准管吸光度。4．计算测定管吸光度血糖（mmol/L）=×5标准管吸光度5．本测定法空腹血糖正常值为3.89～6.11mmol/L(70～110mg/dl)。【临床意义】同上。【结果及分析】【思考题】讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素？