磁免疫生物传感器研究

应用于自旋阀生物传感器的类金刚石保护膜的羧基改性研究刚石保护膜的羧基改性研究姓名：王俊导师：何振辉教授专业：凝聚态物理方向：GMR生物传感器手机：[phone]原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成2015年9月11日2硕士论文答辩：王俊论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。大纲应用背景介绍DLC薄膜制备及羧基改性DLC羧基改性薄膜的表征2015年9月11日3DLC羧基改性薄膜的表征蛋白质固定总结和展望硕士论文答辩：王俊第一部分应用背景介绍GMR生物传感器表面改性技术简介DLC薄膜表面改性技术2015年9月11日4硕士论文答辩：王俊巨磁阻(GMR)效应2015年9月11日5硕士论文答辩：王俊GMR效应示意图(a)随外磁场变化的电阻相应变化(b)多层膜在不同磁场下面的磁化结构(c)多层膜的磁化曲线退火温度对GMR传感器的影响图1-3Co/Cu基和NiFe/Cu基的自旋阀的GMR效应与退火温度的关系[4]2015年9月11日6硕士论文答辩：王俊GMR磁免疫生物传感器工作原理左图为生物免疫应答反应过程原理图，右图为GMR磁珠信号检测原理图2015年9月11日7硕士论文答辩：王俊表面改性在GMR生物传感器中的应用改性技术待测生物体非待测生物体抗体(一抗)GMR传感器GMR生物传感器特点：结合强度小，效率低，无特异性等特点：结合强度大，效率高，特异性好等2015年9月11日8硕士论文答辩：王俊GMR生物传感器改性技术研究现状GMR生物传感器表面改性技术镀金改性法有机薄膜改性法2015年9月11日9硕士论文答辩：王俊配位键固定共价键固定探索类金刚石薄膜改性法共价键固定DLC薄膜表面改性技术背景硬度高电阻率大耐腐蚀性强DLCGMR生物传感器保护膜2002年，Hamers等[40]率先用光化学改性的方法在DLC薄膜表面改性烯烃类有机单分子层(trifluoroethylesterofω-undecenoicacid(TFU))，并成功将DNA分子固定在DLC薄膜表面,其结果发表在Nature杂志上[41]价格低廉DLC薄膜光化学改性的优缺点优点结合力强氢化温度高800C优点缺点取向性好厚度薄改性效率低10小时光化学改性DLC薄膜表面目标有机分子覆盖率为10%研究目标•采用原位低能等离子体辅助改性的方法，在DLC薄膜表面挂接羧基官能团，并用共价键结合法固定蛋白质主要成果研究目标以及主要成果•制备羧基改性DLC薄膜，并对改性后DLC薄膜做氢化处理•用XPS,FT-IR表征，研究羧基官能团的表面覆盖率和结构•研究了退火处理，保存时间对表面羧基官能团的影响•初步研究了DLC薄膜改性对蛋白质固定的影响2015年9月11日12硕士论文答辩：王俊第二部分DLC薄膜制备及羧基改性实验装置DLC薄膜制备及改性工艺DLC薄膜沉积和改性温度测量2015年9月11日13硕士论文答辩：王俊实验装置沈阳中科仪生产的JPGF-450型射频磁控溅射系统，极限真空可达1×10-3Pa。射频电源的工作频率为13.56MHz，溅射气体氩气(99.999%)，溅射输出功率在20～1000W连续可调。2015年9月11日14硕士论文答辩：王俊射频磁控溅射系统结构图2015年9月11日15硕士论文答辩：王俊原位等离子体辅助羧基改性工艺H2第一步，用磁控射频溅射法沉积不含氢的DLC薄膜；第二步，原位通入丙烯酸（AA）气体，在低能等离子体辅助下改性DLC薄膜；第三步，通入H2，在低能等离子体辅助下氢化DLC薄膜表面；2015年9月11日16硕士论文答辩：王俊原位等离子体辅助羧基改性特点原位等离子体辅助羧基改性优点1.改性效率高，污染少，纯度高2.厚度薄(接近单分子层)3.反应条件温和(100℃，气相)缺点1.单体要求容易气化2.反应气体可能污染沉积腔3.必须在无氧条件下进行改性2015年9月11日17硕士论文答辩：王俊DLC羧基改性前后表面形貌表征原始DLC薄膜和氢化DLC薄膜表面形貌相比没有明显的区别。DLC+氢化处理DLC+羧基改性+氢化处理2015年9月11日18硕士论文答辩：王俊DLC薄膜沉积和改性温度测量DLC薄膜沉积和改性时衬底的温度变化曲线用胡昌吉师兄研制的铜-康铜薄膜热电偶测量静态标定：HP34401A6位半数字接点铜康铜6位半数字万用表热端冷端比较法薄膜热电偶测温电路示意图2015年9月11日19硕士论文答辩：王俊DLC薄膜沉积和改性温度测量120W3Pa30min60min2015年9月11日20硕士论文答辩：王俊小结本章介绍了制备和羧基改性DLC薄膜的装置，及其工艺，并对其形貌和厚度进行表征，改性前后DLC形貌没有发生明显变化。该改性工艺条件温和，改性时，样品处于等离子体区外，推测改性过程基本不会影响原有DLC薄膜的保区外，推测改性过程基本不会影响原有DLC薄膜的保护性能。对衬底温度的测量结果显示，改性时薄膜表面的温度低于100C，不会破坏GMR传感器。2015年9月11日21硕士论文答辩：王俊第三部分DLC羧基改性薄膜的表征改性前后样品XPS表征改性前后样品FT-IR表征退火温度，保存时间研究2015年9月11日22硕士论文答辩：王俊估算羧基覆盖率，氢化效果表面官能团种类和结构羧基稳定性和结合强度DLC羧基改性前后XPS表征设备型号:ESCALAB-250单色X射线源:AlKα线全谱扫描范围：100eV全谱步长：1eV窄谱步长：0.05eV窄谱步长：0.05eV窄谱扫描次数：5次C1s峰位定标：284.8eV除特殊说明外，所有样品均不做表面Ar+清洗！DLC羧基改性前后XPS表征分析原始DLC薄膜氢化DLC改性1小时，20WC1s经归一化处理，参考信号强度50000DLC羧基改性后C1s谱分峰拟合改性1小时，20Wsp2碳(284.7eV),sp3碳(285.5eV),C-O(286.4eV),C=O(287.3eV)和-COOH(288.5eV)估算羧基覆盖率κ羧基覆盖率估算方法一[63]该方法假设DLC薄膜表面碳原子均与氧发生反应，生成各种含氧官能团(C-O,C=O,O=C-OH等)，通过计算O=C-OH的C1s分峰面积SCOOH与总的含氧官能团的C1s分峰面积Sco之比，就可以得到羧基数目与DLC薄膜表面碳原子数目之比，即羧基覆盖率κ。基数目与DLC薄膜表面碳原子数目之比，即羧基覆盖率κ。2015年9月11日26硕士论文答辩：王俊COCOOHSSΚ=估算羧基覆盖率羧基覆盖率估算方法二[42]该方法假设改性层的厚度只有单分子层，其厚度(约0.4nm)远小于有机物的光电子非弹性散射平均自由程(简称：IMFP，约3.6nm)，可以忽略改性单分子层对光电子的非弹性散射作用3.6nm)，可以忽略改性单分子层对光电子的非弹性散射作用，通过计算羧基的C1s分峰面积SCOOH与DLC薄膜表面单层碳原子的峰面积Sm之比，即可估算羧基覆盖率κ。2015年9月11日27硕士论文答辩：王俊mCOOHSSΚ=不同DLC薄膜样品表面含氧量和羧基覆盖率SampleModificationconditionsO/C(At.%)Coverage(firstmethod)Coverage(secondmethod)S1-18.1%--S2氢化10.0%10%10%S30W，1h15.7%23%17%S420W，1h19.9%44%43%S520W，1h18.8%40%60%2015年9月11日28硕士论文答辩：王俊改性前后样品XPS表征改性前后样品FT-IR表征退火温度，保存时间研究2015年9月11日29硕士论文答辩：王俊估算羧基覆盖率，氢化效果表面官能团种类和结构羧基稳定性和结合强度傅立叶红外透射光谱(FT-IR)表征设备本实验测量所用仪器为Nicolet6700型傅立叶变换红外透射光谱(FT-IR)-红外显微镜联用仪，扫描次数为64次，扫描步长4cm-1。2015年9月11日30硕士论文答辩：王俊DLC羧基改性前后FT-IR表征分析20W，1h20W，10min氢化DLC2015年9月11日31硕士论文答辩：王俊氢化DLCDLC羧基改性前后FT-IR表征分析1736171820W，1h20W，10min2015年9月11日32硕士论文答辩：王俊173620W，10min氢化DLCDLC表面羧基结构分析丙烯酸二聚体1695cm-1开链缔合体1724cm-1丙烯酸单体1740cm-1羧基改性DLC薄膜表面两相邻羧基官能团形成的缔合体结构1736cm-1对应**C=O1718cm-1对应*C=O2015年9月11日33硕士论文答辩：王俊改性前后样品XPS表征改性前后样品FT-IR表征退火温度，保存时间研究2015年9月11日34硕士论文答辩：王俊估算羧基覆盖率，氢化效果表面官能团种类和结构羧基稳定性和结合强度羧基改性DLC薄膜表面羧基温度稳定性研究17059.3×10-4Pa，120C，30min.S9，S10为同一批次改性样品，射频功率20W，改性时间1小时，2015年9月11日35硕士论文答辩：王俊17381718未经退火处理保存时间对羧基改性薄膜的影响分析保存条件DZF-605型真空干燥箱适合于样品的长期保存，而送样时，为了尽可能避免空气中的杂质污染，使用如图3-8所示的便携式真空器皿图3-8DZF-605型真空干燥箱(左图，用于样品长期保存)，便携式真空器皿(右图)2015年9月11日36硕士论文答辩：王俊保存时间对羧基改性薄膜的影响分析17361718立即送样S6，S11为同一批次改性样品，射频功率20W，改性时间1h2015年9月11日37硕士论文答辩：王俊保存50天小结XPS和FT-IR对比分析，确定改性后的DLC薄膜表面存在羧基官能团，原位低能等离子体辅助法的改性效率较目前广泛研究的光化学改性方法有明显提高等离子体辅助可以明显的提高羧基覆盖率等离子体辅助可以明显的提高羧基覆盖率退火处理，保存时间试验显示羧基官能团与DLC薄膜结合牢固，有化学键结合的特征。2015年9月11日38硕士论文答辩：王俊第四部分蛋白质固定蛋白质固定原理蛋白质固定试验流程固定蛋白质SEM表征2015年9月11日39硕士论文答辩：王俊蛋白质固定原理(A)(B)图4-2蛋白质(实心球2)固定在羧基改性DLC薄膜表面(实心球1)的原理图，EDC/NHS为交联剂[100]2015年9月11日40硕士论文答辩：王俊蛋白质固定试验流程第一步，用原位低能等离子辅助法制备表面羧基改性DLC薄膜第二步，使用EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)交联剂活化DLC薄膜表面羧基官能团；第三步，将蛋白质溶液滴加到DLC薄膜表面，蛋白质与DLC薄膜表面形成肽键，固定在DLC薄膜表面。2015年9月11日41硕士论文答辩：王俊蛋白质固定实验及样品编号研究不同浓度EpCAM抗体在阴性阳性样品表面固定情况，样品的编号及抗体浓度如下：样品类型阳性阴性编号S20S21S22S23S24S25编号S20S21S22S23S24S25EpCAM浓度24×稀释12×6×24×12×6×阳性样品：表面羧基改性的DLC薄膜阴性样品：表面氢化处理的原始DLC薄膜2015年9月11日42硕士论文答辩：王俊固定蛋白质SEM表征结果S2024×稀释S2324×2015年9月11日43硕士论文答辩：王俊固定蛋白质SEM表征结果S2112×S2412×疑似EpCAM抗体2015年9月11日44硕士论文答辩：王俊固定蛋白质SEM表征结果S226×S256×2015年9月11日45硕士论文答辩：王俊小结SEM表征结果说明羧基改性可以促进DLC薄膜吸附生物分子，包括EpC