分子流行病学概述及我国分子流行病.

分子流行病学概述及我国分子流行病学研究现状提纲：一、分子流行病概述(一)定义(二)分子流行病学研究内容和范围(三)分子流行病学常用的主要研究方法二、我国分子流行病学研究现状(一)病原体分型和检测研究(二)人群中疾病流行规律、传播机理研究(三)在慢性病研究中的应用(四)在遣传性疾病研究中的应用(五)在疾病防治方面的应用三、存在问题和前景(一)存在问题(二)前景流行病学是研究人群中疾病和健康的分布，探索影响分布的因素，并在此基础上制定预防策略的措施的一门学科。一直以来，流行病学在疾病的预防和治疗，疾病危险因素的研究和控制方面都起着十分重要的作用。近二三十年来，生物学技术尤其是分子生物学技术取得了突破性进展，并逐渐渗透到各个医学领域。分子生物学的理论和技术不断应用于传统的流行病学，并在此基础上形成了一门新的分支学科——分子流行病学。一、分子流行病学概述（一）定义分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防治措施的科学。这一定义包含了几个要点：（1）分子流行病学是流行病学的一个分支，是传统流行病学与新兴的生物学技术，特别是分子生物学技术之间的一门边缘学科、交叉学科；（2）分子流行病学的主要研究对象是各种生物学标志；（3）与传统流行病学不同，分子流行病学还研究暴露因子引起疾病的相关过程，以测定各种易感性标志，并提出针对性预防措施，尤其是阻断暴露因子进入体内后致病进程的初级预防措施。图1传统流行病学与分子流行病学的关系（Schulte，1993）表1传统和分子流行病学的比较传统流行病学分子流行病学推动力公共卫生现代科学研究水平人群个体/器官组织/细胞/分子研究样式人口统计学/社会科学临床/实验认识论策略自上而下自下而上预测水平人群个体综合上述国内外学者的分子流行病学研究实践及其对分子流行病学的理解，提出如下定义：分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防制措施的科学。1．疾病病因的探讨疾病的发生，大多是环境因素与遗传因素同时起作用。只是有些疾病以环境因素为主，有些则正好相反。遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。因此，分子流行病学研究在这方面起着非常重要的作用。（二）分子流行病学研究内容和范围意大利学者Dragani在1996年名古屋会议上报告，以前一般认为肺癌的家庭聚集性很少见，故基因因素的作用很小。但他从小鼠模型发现染色体上存在易感或抑制肺癌的基因位点。此后作者在人群中选择病理确诊的肺腺癌125例作为病例组，另在健康供血员人群中随机选择179名作普通人群对照检测显示，在KRAS2基因第2外显子下游有个基因位点与拮抗肺癌产生并延长肺癌患者的生存期有关。表2肺腺癌病人和普通人群对照中KRAS2Rsal等位基因的基因型频率基因型a普通人群肺腺癌观察数期望数bA1/A1A1/A2A2/A29668158959481.557.812.7计179152152注：a：等位基因A1为无酶切位点；A2为有酶切位点；b：按普通人群的频率推算所得；c：卡方检验Ρ=0.025。2．危险因子致病机制的研究分子流行病学不仅研究环境与宿主体内的致病因子，而且着重研究这些致病的危险因素，特别是化学物质与生物活性物质从暴露开始至疾病发生全过程的各个环节。癌症发病的分子流行病学研究是个典型的例子。20多年来，对与癌相关的各种生物学标志，致癌物的种种生物效应标志，如DNA加成物（adduct）等等进行了十分广泛的研究，有关报道相当丰富，积累了很多资料，提出了一些很有意义的假设。目前认为，致癌化学因子进入体内，最终引起临床癌症过程的基本框架大致如下。致癌作用是多阶段的，正常细胞转变为癌细胞经历了致癌作用累积而又连续的几个阶段：启动（initiation）、促进（promotion），转化（conversion）和发展（progression）。在启动阶段，机体暴露于环境致癌化学物质，致癌物进入体内需经代谢活化（metabolicactivation），变成反应性亲电物质（reactiveelectrophilicform），再与DNA反应形成DNA加成物。在致癌物进入体内后，这种反应通常仅需几小时就可完成。当DNA复制时，这种对DNA的化学损伤可引起基因的变化，这些基因的变化如果逃避了DNA修复作用，就会被固定下来。某些基因损伤可造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，从而使正常细胞变成启动细胞。这个过程往往仅需几天时间。但促进过程却是人类致癌过程中最长的阶段，启动细胞呈克隆样扩展需10年甚至更长。促进阶段的细胞还需经过进一步的基因改变，并获得侵袭性与转移的恶性表型，才能进入转化与发展阶段，而这后2个阶段大概需1~2年的时间。图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略3．疾病易感性的测定个体对疾病都存在一定的感受性，称之为易感性。以往一般认为，只有传染病才有确定的易感性，可以用测定机体内是否存在某种特异性保护（中和）抗体的方法了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力。然而，近来分子生物学与免疫学研究发现，机体对很多疾病也同样存在着易感性，且往往与个体的某些基因型别或序列或其表达产物有关，如果与遗传有联系，往往称之为遗传易感性（尤其慢性病）。同时还发现很多传染性疾病的易感性，除了与能刺激机体产生特异性抗体的致病微生物有关外，也和机体的某些基因类型有联系，因为后者决定了机体对致病微生物的免疫反应的方式与强度。对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析，可以应用同时检测特异基因标志的病例对照研究进行。例如，如果某个特异性的等位基因在某病病人中明显高于对照，这就提示该等位基因的存在可能使机体对某病具有一定的易感性。目前，与遗传易感性相关研究较多的一个基因区域是人类第6号染色体短臂上的人类白细胞抗原（HLA），其原因可能有二，首先HLA基因区有高度的多态性，其次为HLA的功能是介导对特异性抗原的免疫反应。Erlich的研究发现，HLAⅡ类单倍体（DRB1﹡1501-DQB1﹡0602）的比例在受到人乳头瘤状病毒（HPV）16型感染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高。4．流行规律的研究这方面研究最多的是传染病。在传播范围的确定，传播途径的判断与传染源的追索方面，分子流行病学可以发挥无与伦比的作用。因为以往常常是根据宏观流行病学调查分析，再辅以病原体分离与血清学分型来分析流行规律。然而近年的很多分子流行病学的研究表明，上述的方法有时不够精确。例如，尽管传染源与接触者之间的病原体的血清学型别一致，但如果基因型不一致，就不能确切判定两者的传播关系。（1）传播范围的确定按照传染病流行病学基本理论，在一次爆发或流行中，其受染范围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的区域，以确定受染或流行涉及范围。可是，过去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可能出现错误的判断。分子流行病学研究缩小了常规流行病学调查所推测受染范围，从基因水平上证实爆发的受染人数与传染来源。（2）传播途径的判定以往，传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志。近来分子流行病学研究引入一些新的技术，如分子进化诊断（molecularevolutionarydiagnosis）。例如，不少分析性流行病学研究与血清流行病学研究均认为丙肝病毒（HCV）可经性传播途径感染配偶。然而，出人意料的是，在1993年东京国际病毒性肝炎会议有2篇报道，用分子进化法进行的研究提出了相反的意见。如Ohno筛检50对至少有一方抗-HCV阳性的夫妇，发现仅4对夫妇双方抗-HCV均阳性。用PCR扩增、测序分型，结果其中2对配偶男女之间的HCVRNA彼此的基因型别不同，由此可排除性传播所至；另2对夫妇之间型别相同，用分子进化诊断判定男女病毒株的分株时间（divergencetime），发现第1对配偶的分株时间发生在45~52年前，而结婚却才32年；第2对配偶分株时间已有30~34年，结婚时间则在25年前。基于这些研究结果，作者认为HCV经性传播的可能性很小。（3）传染源的追索判定传染来源或两人之间的传播关系应符合如下4条原则：①A（传染源）与B（受染者）的接触是有效接触（暴露）；②接触发生在A的传染期内；③B的发病时间是在暴露后该病最短与最长潜伏期之间；④A与B受染致病的血清学型别一致。如今看来，第④条应该用基因型别来代替，而基因序列的测定与型别差异的鉴定虽然比较复杂与精细，但可靠得多。美国1990~1991年报道佛罗里达一个口腔诊所有1名患有艾滋病的牙医，被他看过病的患者中有7名后来感染了HIV，然而经过分子流行病学研究发现，其中5名患者的HIV与牙医的HIV有共同的氨基酸特异模式（signaturepattern），而且序列的差异率5.0%，为同一病毒株；而另2名患者的HIV则与牙医的不同。因此，通过序列分析，从分子水平确定了前5名病人的HIV感染是由牙医引起，而后2名病人的传染来源则不是牙医。5．防制措施的研究（1）传染病预防因为在传染病流行的研究中应用了分子生物学等现代技术，对传播与流行范围的确定，传播途径、传播媒介与因子以及传染来源的推断更为精确，所以提出的控制措施更有针对性，更有成效。传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种。已有很多传染病由于实施了安全、有效、广泛的免疫接种，发病率已大幅度地下降。但少数疫苗由于某些原因可以使极个别疫苗接种者发生被免疫的疾病。过去，仅能根据接种史与分离病原体作血清学或生化反应来进行判断，但可靠性不强。而现在用分子生物学技术作基因序列分析可以确实地判定是否为疫苗株引起的发病。（2）非传染病的预防由于分子流行病学不仅研究疾病的危险因素，而且研究其引起疾病整个过程中的所有环节，也即研究这些致病因子的致病机制，因此，这就为疾病的三级预防特别是第I、II级预防采取针对性措施奠定了科学的基础。在这个意义上也可以说，分子流行病学的建立，为疾病的三级预防开辟了十分广阔的前景。图-2以癌症为例，描绘了应用分子流行病学方法研究致癌因子导致正常细胞基因改变===选择性克隆扩增====基因改变====细胞异质化====临床癌症过程的主要阶段，以及针对这些改变所能采取的不同阶段的具体预防与干预措施：防止暴露、预防最终致癌因子的形成、阻断其与宿主基因间的相互作用、抑制癌前起始或启动细胞的产生、抑制选择性克隆的扩散、早期诊断、手术与放射治疗、化学治疗；预防复发与继发肿瘤。图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略分子流行病学在某种意义上讲，是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学，需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合。因此，分子流行病学的研究方法大致可以分为二大类：实验室技术与流行病学现场研究方法。（三）分子流行病学常用的主要研究方法1．实验技术（1）基因序列分析通过需测定的基因（靶基因）序列提取，克隆入测序载体或用PCR直接电泳测序。这是测定基因核酸序列及其类型、突变部位与方式的最可靠的方法，在传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分常用。但技术操作比较复杂，分析也需细致并具备一定经验，在国内，目前还只在一些大学、研究所、大医院等开展，表3常用检测基因变异方法。表3基因变异的检测和筛查方法比较方法PCR应用变异部位和内容确定检出率（%）主要特点1Southern印迹杂交2核酸序列分析（测序）3ASO探针杂交4RNaseA裂解5化学裂解6变性梯度胶电泳（DGGE）7单链构象多态分析（SSCP）8多重PCR9PCR-RFLP10等位基因特异性PCR-+++++++++CAABBCCAA