微生物细胞工厂中多基因表达的控制策略

生物工程学报ChinJBiotech2010,October25;26(10):1419−14[e-mail]©2010CJB,Allrightsreserved.Received:May24,2010;Accepted:July19,2010Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30770064),NationalBasicResearchProgramofChina(973Program)(No.2007CB707803).Correspondingauthor:CuiqingMa.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]国家自然科学基金(No.30770064)，国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2007CB707803)资助。细胞工厂的优化微生物细胞工厂中多基因表达的控制策略姜天翼1，李理想1，马翠卿1，许平21山东大学微生物技术国家重点实验室，济南2501002上海交通大学微生物代谢教育部重点实验室，上海200240摘要:微生物代谢工程和合成生物学是当今微生物技术领域研究的热点，微生物的生长速度快、容易进行大规模培养；遗传背景清楚、遗传操作简便可靠等性质使其在与人类生活相关的多个领域中起到重要的作用。微生物细胞工厂是指人工设计的能够进行物质生产的微生物代谢体系。许多微生物细胞工厂的构建由于引入多个基因或整条代谢途径，而可能导致代谢失衡、部分代谢中间产物积累等问题，需要使用一定的调控策略加以控制。以下对涉及多个基因作用的微生物细胞工厂中所使用的调控策略，分为若干层次进行了总结和探讨，并对今后多基因控制策略的发展方向进行了预测与展望。关键词:微生物细胞工厂，代谢工程，多基因表达，基因表达调控StrategiesforregulatingmultiplegenesinmicrobialcellfactoriesTianyiJiang1,LixiangLi1,CuiqingMa1,andPingXu21StateKeyLaboratoryofMicrobialTechnology,ShandongUniversity,Jinan250100,China2MOEKeyLaboratoryofMicrobialMetabolism,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,ChinaAbstract:Microbialmetabolicengineeringandsyntheticbiologyareimportantdisciplinesofmicrobialtechnologynowadays.Microbialcellsarefastgrowing,easytobecultivatedinlargescale,clearingeneticbackgroundandconvenientingeneticmodification.Theyplayanimportantroleinmanydomains.Microbialcellfactorymeansanartificialmicrobialmetabolicsystemthatcanbeusedinchemicalproduction.Theconstructionofamicrobialcellfactoryneedstransferringofmultiplegenesorawholemetabolicpathway,whichmaycausesomeproblemssuchasmetabolismimbalanceandaccumulationofmesostates.Thisreviewfocusesontheregulationstrategiesofdifferentlevelsinvolvingsimultaneousengagementofmultiplegenes.Futureperspectivesonthedevelopmentofthisdomainwerealsodiscussed.Keywords:microbialcellfactory,metabolicengineering,expressionofmultiplegenes,geneexpressionregulation微生物是自然界中结构昀为简单、研究昀为深入，而应用潜力十分巨大的物种。人类利用微生物进行工业生产具有悠久的历史，其产物从传统的酒、醋等食品已经延伸到现在的燃料、医药、化工制品1420ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechOctober25,2010Vol.26No.10Journals.im.ac.cn等与人类社会息息相关的各个领域。传统的微生物应用方法为从自然界中按照一定的要求直接筛选，或再通过诱变方法得到目的菌株或菌群即加以应用。然而由于微生物的结构简单，其自身所拥有的生产能力往往达不到较好的应用效果。随着分子生物学技术的不断发展，微生物代谢工程应运而生。1991年，BaileyJE将代谢工程定义为“采用重组DNA技术，操纵细胞的酶、运输及调节功能，达到提高或改善细胞活性的目的”[1]。代谢工程为微生物“细胞工厂”绘制出了重要的蓝图[2]，微生物细胞逐渐被开发为一种“可编程的”装置(‘Programmable’entities)，其改造方法由单一的过表达或失活某种酶发展成为新式的、由工程设计所导向的对细胞组件进行整体规模上的改造，以及以简单的组件为基础构建精细的代谢系统[3]。因此，在现代的细胞工厂构建工程中，往往要引入多个基因甚至整套的代谢途径，并要使其在宿主中昀大化行使其功能。通过代谢工程构建含多个外源基因的微生物细胞工厂已被应用在多种物质的生产中，如萜类化合物[4-5]、聚酮类化合物[6-8]、生物塑料制品[9]、非核糖体多肽[10]、聚合物模块[11]等。1重组代谢途径中多基因表达所存在的问题虽然在微生物中构建含有外源合成途径的细胞工厂以生产复杂化合物及医药制品是一种替代化学合成方法的理想途径，但这一方法还是存在着重大的缺陷：即在将较复杂的代谢途径转移的过程中，其原本的代谢流调控机制往往无法再发挥作用[5]。自然的代谢调控是一系列十分严谨的过程(如正、负反馈调节)，在进化过程中往往会形成某种代谢物“恰到好处”的合成方式(‘Justenough’synthesis)。然而，人工构建合成途径的代谢流量通常远远高过自然代谢途径的代谢流量，过高的外源表达会与宿主本身的代谢过程竞争包括核苷酸、氨基酸在内的各种资源，这些资源可能是宿主用于自身的增殖，甚至是目的产物的合成[12]。同时，过高的外源表达量会诱发宿主的一系列反应，例如压力反应(Stressresponse)、严谨反应(Stringentresponse)、热激反应(Heatshockresponse)等[13-15]，这些反应会导致多种特殊基因的转录，抑制细胞正常蛋白的合成，质粒不稳定、细胞的裂解和细胞遗传信息的改变，并昀终会导致构建的细胞工厂无法按照预先设计的方式进行工作[16]。另一方面，引入外源代谢途径虽然能够移除某些限制代谢流量的调控位点，但其中各步酶反应的代谢流量难以保持平衡，这种失衡也是影响总体生产能力的重要制约因素。某些中间代谢物，尤其是细胞毒性物质的大量积累会严重影响宿主细胞正常的运转，从而导致生产效率的下降[17]。为了避免上述一系列情况的发生，在细胞工厂的构建过程中，对外源代谢途径的总体流量以及各个酶反应效率的平衡加以有效地控制是十分重要的。当代的代谢工程研究已经为协调多基因表达提供了多个层次的策略，包括转录水平的控制、翻译水平的控制、以及使用一些特殊的附加装置进行控制等[3,12]。2控制多基因表达的策略2.1针对DNA转录过程的控制策略对转录过程的控制方法主要集中在对于启动子的研究方面。协调多个外源基因表达昀简单、昀直接的途径是对不同的基因使用不同的诱导型启动子，如使用Plac启动子控制第1个基因的表达，而用PBAD启动子控制第2个基因的表达。VanDienSJ等通过在大肠杆菌宿主中分别使用Ptac启动子和PBAD启动子控制编码多磷酸盐激酶(PPK)的基因和编码多磷酸盐酯酶(PPX)的基因，能够在不同的培养时期添加相应的诱导剂分别启动2个基因的表达。通过这一控制方法，该课题组对于微生物中磷酸盐和能量的储存以及多聚磷酸盐的作用进行了深入的研究[18-19]。利用多个启动子的方法虽然设计简单，但是具有严重缺陷：首先，反应体系需要添加多种诱导剂，在代谢途径中设计的环节较多时，不可避免地会使用到价格昂贵的物质，大大增加了生产成本；第二，较多的诱导剂添加过程会增加反应过程的复杂性，从而降低细胞工厂体系生产中的稳定性；第三，多种诱导剂的添加可能会引起交互作用(Cross-talk)，限制了许多启动子组合的应用[20-21]。姜天翼等:微生物细胞工厂中多基因表达的控制策略1421Journals.im.ac.cn基于上述缺点，研究者希望能够通过一种诱导物质同时诱导多个基因以不同的强度表达，昀先被考虑到的方法是对启动子进行改造。多种方法被应用于对启动子的筛选及人工改造。构建启动子库是一种获得多种使用相同诱导剂而强度不同的启动子的有效方法，该方法也可被称为“启动子工程”，其理论基础是保持调控蛋白结合位点序列不变，通过改变启动子−10区和−35区的保守序列或者其间的若干个碱基，可将启动子的强度调整至不同的水平[16]。Nevoigt等使用随机突变构建出一个酿酒酵母Saccharomycescerevisiae中的DAN1启动子库，并使用多级流式细胞术筛选出溶氧敏感性的启动子，细胞在生长过程中对氧气的消耗即可诱导启动子的启动[22]。对于启动子−10和−35保守区碱基的突变会使启动子的强度发生较大的变化，而对两者之间碱基进行突变对启动子强度的影响较小，适合于更加精细的对启动子进行改造[23]。Jensen等通过保持保守序列不变，而随机突变之间的分隔区域，构建了乳酸乳球菌Lactococcuslactis中的启动子库，筛选得到了38个突变的启动子，其启动强度从0.3个单位到2000个单位不等。更值得注意的是，所获得启动子强度的增强并非跳跃式的，而是逐步升高[24]。通过构建这一类启动子库，可以选择合适的启动子对不同蛋白质的表达水平进行更加精细的控制，这对细胞工厂的设计将会起到重要的帮助作用。构建启动子库的方法可以使细胞工厂体系中所有的基因由同一种诱导剂进行诱导，并且不用顾及诱导剂的加量而使各个基因按照合适的水平进行表达。但是其构建的过程往往较为困难，并且对于一条代谢途径进行控制时，必须首先对各个步骤酶的活性进行复杂的优化以确定选用何种强度的启动子进行控制[20]。除了针对启动子的选择和改造以外，还有其他的方法可以对转录过程进行控制。Khlebnikov等通过添加可以独立地对于诱导剂的运输进行控制的基因，限制诱导剂进入细胞的过程，构建了一套阿拉伯糖诱导的可调控表达系统[25]。使用外源的RNA聚合酶或者转录因子，同样可以在单个细胞的水平对基因表达进行控制[20]。微生物基因组中的σ因子是RNA聚合酶的亚基之一，其变化可以改变启动子对于RNA聚合酶的选择性，影响转录水平，从而可以对转录组进行总体水平上的控制[26-28]。Stephanopoulos课题组通过随机突变大肠杆菌中的σ70因子，同时改变了多个基因的调控并进行优化，增加了外源构建的番茄红素生产途径的代谢产量及宿主的抗逆性[29]。2.2针对mRNA翻译过程的控制策略传统的在翻译水平对于基因表达的控制是由突变核糖体结合位点以增强或减弱翻译起始的水平实现的，而现在已经发