您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 医学/心理学 > 药学 > 个体化药学实验指导20141013
一、检测流程①富集白细胞样本。样本处理方法可参照一、(一)至(五)中的内容。②将待测样本、质控加入到试剂中,上机,编辑样本名称并选择基因型。某一批次的试剂第一次检测时,须加质控用于设定参数,之后的检测不需要再加质控。选择基因型时,样本选择相应的基因型,质控选择“通用”③设备运行检测。④根据质控的St值关系,计算出ΔSt,依据“三、1”的内容,进行MaxSt差值上限与MinSt差值下限(在博奥客户端中,此二项为ΔSt上限、ΔSt下限)的设定。必要时,修正St值上限与St值下限等参数。⑤重新加载实验数据文件,进行结果的判定。(一)可检测样本1、血液样本:2-3ml静脉全血(不需空腹),使用一次性真空抽血管(EDTA抗凝紫帽管)采集,于4℃或-20℃低温保存,保存时间不宜超过24h。2、组织样本:样本量大于0.3g(约黄豆大小),普通肌肉或肠胃黏膜等组织样本均可。使用石蜡或其他染色液处理的样本需要清除包埋剂或染色液。3、纯化的基因组。(二)试剂与器材准备1.商品名:耀金保;用于在进行SNP分析前对血液、组织标本的保存。2.商品名:耀金分/耀金染;用于荧光染色原位杂交及染色体核型分析、化学药物用药指导时的样本分析。3.10×NH4Cl预处理液。处理血液样本时用于裂解红细胞。4.1×NH4Cl。使用注射用灭菌水,按照注射用灭菌水:预处理液=1:9的比例,将预处理液10×NH4Cl稀释为1×NH4Cl,备用。5.1000ul、200ul、2.5ul移液枪及枪尖,1.5ml离心管(灭菌)。6.液氮。用于组织样本处理。7.陶瓷研钵、研棒。用于组织样本的处理。8.注射用灭菌水。(三)样本处理方法—从血液样本中富集白细胞1.对用EDTA抗凝管采集到的临床全血样本进行编号(年、月、日、患者编号),上下颠倒混匀;取若干1.5ml离心管,并在管盖上编写序号,与抗凝管上编号一致。2.在1.5ml离心管中加入1.2mL1×NH4Cl预处理液。3.取150ul混匀的临床全血,加入对应编号的1×NH4Cl预处理液离心管中。4.上下颠倒10次,室温静置5min,此时1×NH4Cl裂解红细胞。血样与1×NH4Cl混匀后,液体颜色会逐渐变为澄清的红色。5.室温3000rpm(或500-700g)离心5min,将上层透明红色液体吸取干净,注意避免吸走沉淀在管底的白细胞。注:离心后管底部可见约2×2mm的白细胞沉淀,如白细胞团过小,须重复2-5步骤。6.加入1mL1×NH4Cl(或生理盐水)彻底重悬白细胞,室温3000rpm(或500-700g)离心5min,将上层液体吸干净,注意避免吸走管底白细胞。7.向富集有白细胞的离心管中加入50ul耀金保,反复吹打混匀。8.室温静置20-30min,期间颠倒混匀2次,待检测。(四)样本处理方法—组织样本处理1.在洁净的陶瓷研钵中加入待处理组织样本,加入足量液氮。2.使用陶瓷研棒将组织样本研磨破碎,尽量破碎组织样本的细胞结构。3.向研钵中加入100ul耀金保,使用研棒搅动以溶解破碎的样本。4.将溶有样本的耀金保吸取到1.5ml离心管中,待检测。(五)样本处理方法—纯化的基因组纯化的基因组不需要进行预处理,也不需要使用耀金保保存。可以直接加入到试剂中进行检测。(六)上样1、根据需要检测的基因位点,取出相应耀金分/耀金染试剂,并将样本编号标注在试剂管盖上;如果试剂粘附在管壁或者上盖,需要离心,保证检测体系完整。2、向相应编号的耀金分试剂中加入1.5ul处理后的白细胞样本(加样时应再次混匀,枪头在管内液体中间吸足样本,加入量过少会直接影响结果);3、盖紧管盖,短暂离心,上机检测。(七)软件运行(以天隆仪器客户端作为演示)1、打开检测仪器电源,仪器进行自检运行;双击点开“个体化药学服务平台”分析软件;2、在提示框中的“温控实验项”选择待检基因类型组别;在“基因位点项”选择该次检测的SNP位点。点右下角“选择”按钮进行下一步。每一个基因组里的SNP位点可同批次进行检测(各基因位点在打开软件之后的“样本设置”界面的“基因类型”下拉框中选择)3、对待检标本进行设置(1)点击“新建”按钮,或在“文件”选项里的“新建”,弹出保存对话框,设置文件名和保存路径。(也可以不点击新建,在进行样本设置过程中会自动弹出保存对话框,设置并保存后不再提示。)(2)按照位置从A1开始的顺序,在“名称”栏对待检样本进行编号。在“基因类型”栏选取该标本待检的基因名称。选择基因型时,样本选择相应的基因型,质控选择“通用”。4、点击右上角“开始”按钮(三角图形),开始运行检测。5、检测运行完成后。软件“数据分析”界面给出基因型分析结果。注意事项:1)待检样本放入仪器的位置顺序。与软件“样本编辑”界面中位置顺序一致。2)运行开始后,不能关闭软件或者进行其他操作。检测完成后,数据会自动保存。3)在检测过程中,电脑不能进入待机或者休眠。使用前,需将待机、睡眠、关闭显示器等设置修改为“从不”。4)检测过程中,如果需要查看先前的数据,可以重新打开客户端软件,不会影响正在运行的原件。但是,此时不能修改各位点参数、温控等设置等。5)若检测样品显示的结果为“重测”,则表示该样品无阳性检测信号或信号过低。“重测”往往是因为样本量太低,加入的样品DNA拷贝数,达不到本方法的检测下限3000拷贝,应增加样品DNA拷贝数后,重新检测。(八)质控品说明1、标准品质粒每个SNP位点对应三个标准品(野生纯合型、突变杂合型、突变纯合型),是根据NCBI的标准序列、人工合成的DNA标准片段。标准品为1.5ml离心管包装。每个SNP位点有对应标准品,标准品编号与样本分析试剂盒上基因位点编号对应。2、质控的制备分别从每个标准品中取1.5ul标准DNA序列,加入到分析样本处理试剂,用于检验的质控。每个SNP位点对应三个标准品,对应做三种质控。质控试剂有该位点的三个基因型的标示,质控试剂与普通检测试剂相同,可以依据实际情况调换使用。3、质控的使用质控主要用于“MaxSt差值上限”与“MinSt差值下限”(在博奥设备客户端中,此二项为“ΔSt上限”、“ΔSt下限”)的设定。每使用一批新的试剂时,应用该批试剂随带的三种基因型的质控品进行系统参数校准。若连续使用同一批试剂,在累计完成50份临床标本检测时,应进行一次新的质控检测。4、若质控在“通用”类型进行试验后,计算出的ST差值不能按照从小到大或从大到小(A-B-C或C-B-A,质控杂合突变基因型ST差值必须在中间)时,必须在第一时间,将质控试验结果文件以及软件一起打包发送至我司技术支持部。我公司技术支持服务邮箱为:support@sino-era.com。(九)试剂与样本的保存1、血液标本:4℃可临时存放,-20℃冷冻保存时间不能超过1周。长时间冷冻或反复冻融会破坏白细胞结构,导致富集的样本不足,使用分析保存液(耀金保)保存的待检血样,于4℃临时保存,于-20℃可保存至少3月。2、分析保存液:可于4℃低温保存。3、NH4Cl预处理液。10X或1X的NH4Cl预处理液在4℃避光保存,可长期保存。在保证容器无菌时,1XNH4Cl可预先大量配制。(十)电脑与客户端软件设置1、在检测过程中,电脑不能进入待机或者休眠。使用前,需将待机、睡眠、关闭显示器等设置修改为“从不”。2、目前软件能够支持WindowXP、Win7、Win8操作系统。在安装时,需要由工程师安装相应的驱动软件,并进行通信端口的设置。因此不建议随意更换操作电脑。3、在客户端软件的更新升级时,需要确认电脑通信端口与软件中的端口相一致。进入电脑“设备管理器”界面,打开“端口”下拉菜单,将“USBserial…(COM?)”中的串口设置为串口X(如COM3,且此端口不能被其他设备占用);在客户端软件中,将软件的端口也设置为X端口(如COM3)即可。4、“管理员配置”密码为20060117。“MaxSt差值上限”与“MinSt差值下限”(在博奥设备客户端中,此二项为“ΔSt上限”、“ΔSt下限”)的设定不需要密码。其他参数的修改需要以此密码获得权限。二、检测原理在检测体系中,针对SNP突变位点的碱基,设计有两条配对碱基不同、荧光标记也不同的探针,能够分别识别一种突变。在纯合子样本中,当某条探针与模板完全匹配时,该探针的竞争能力最强,能够优先与模板结合并产生荧光信号,此时,该探针的St较小,信号增长快并信号值较高,而另一条探针则St较大,信号增长慢且信号值较低。(St是按照特定的运算规则得到的一个反应循环数值。良好的荧光曲线一般为S型或接近S型,St一般在S型曲线下部的拐点位置,此时,两条探针间的竞争能力的差异表现的最明显。)以CYP2C19*3的检测产品02CYP2C19*3为例。该产品的每管试剂内,都有FAM-G探针、HEX-A探针。FAM-G探针能优先与突变位点碱基为G模板的结合,并由通道1进行信号的检测,HEX-A探针能优先与突变位点碱基为A模板的结合,并由通道2进行信号的检测。如果样本为纯合的AA基因型,则HEX-A探针优先于模板结合并快速增长(绿色曲线),FAM-G探针与模板的结合能力弱,信号产生时间晚且信号增长慢(蓝色曲线),如图1。在纯合GG型样本中,情况与上面相反,如图2。在杂合AG型样本中,两条探针都能顺利的与目标模板结合并产生信号,其St值较接近,信号的增长也较一致。三、分型判读的依据在对数据进行分型判读时,软件的运算逻辑是:①依据St值上限与St值下限确定有效循环数范围,范围之外的循环数值及信号不考虑;②依据通道一阶导阈值,排除信号过低的循环及其信号③依据MaxSt差值上限与MinSt差值下限,判定基因型,得出最终分型结果。1、依据St的ΔSt的分型分型主要的依据是St的差值。在参数的设定中,ΔSt是两个通道的St值的差值,即ΔSt=St通道1-St通道2。在普通的单个SNP检测中,由于FAM-探针、HEX-探针对模板结合能力的差异,使ΔSt存在正值、负值的差别,其正负差异及差值的大小是进行基因分型的主要依据。以2位点(CYP2C19*3)的检测数据(哈医大二院演示实验数据)为例,其检测数据如下:AA型Stchannel1=35.6609Stchannel2=27.0791ΔSt=+8.6(图1)GG型Stchannel1=31.4214Stchannel2=37.4288ΔSt=-6(图2)AG型Stchannel1=29.4933Stchannel2=28.4751ΔSt=+1(图3)在产品的研发和出厂检测中,对产品的ΔSt的控制要求为:纯合质粒中ΔSt4(上限),ΔSt-4(下限),杂合质粒-2ΔSt2。2、依据信号阴阳性的分型对于70、65等位点,其突变方式与普通的SNP不同。这些位点是缺失/加倍等突变方式,其探针体系包括一条用于检测缺失/加倍等突变方式的探针和一条用于保证体系正常反应的内参。当内参探针具有正常可信的荧光信号时(一般在500以上),表明此管试剂的检测正常,数据可信。在阳性样本的检测中,特异的探针的信号是高于内参信号的。因此,在70等位点中,如果出现两条荧光信号且探针信号高于内参信号,我们可认为此位点的阳性。以70位点为例,“1502+”表示结果为1502阳性,而“1502-”为体系的内参,用于保证实验反应正常。因此“1502+1520-”和“1520+1502+”的结果均表示1502阳性,而“1502-1520-”表示1502阴性。与之类似的是3101类、5801类位点。四、主要参数及其意义1、MaxSt差值上限与MinSt差值下限(在博奥客户端中,此二项为ΔSt上限、ΔSt下限)MaxSt差值上限(ΔSt上限)、MinSt差值下限(ΔSt下限)用于将两种纯合基因型、杂合基因型相互分开,是主要的分型参数。若某样本的ΔStMinSt差值下限,则为通道1基因型的纯合子;若某样本的MinSt差值下限ΔStMaxSt差值上限,则该样本为杂合型;若MaxSt差值上限ΔSt,则该样本为通道2基因型的纯合子。可以简单的认为,在纯合子中,St值较小的基因型
本文标题:个体化药学实验指导20141013
链接地址:https://www.777doc.com/doc-7414749 .html