ATP-TCA

ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)的建立及其临床应用研究硕士研究生：傅军导师：张伟研究员答辩提纲第一部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述第二部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及质量标准的建立第三部分：ATP-TCA技术的临床应用研究第一部分ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述研究背景化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性等因素有关。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。1.主要的药敏检测方法及其存在的问题药敏检测方法存在问题集落形成法（HTCA）标本可评价率低，仅有40~70％。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有40～60％四唑蓝比色法(MTT)敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内细胞毒性差异染色法(DiSC)可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高，仅有70～80％阳性预测值较低，仅有70～80％胸腺嘧啶核苷掺入法(3H-TdR)实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有70～80％测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性理想的药敏检测方法应该具备的条件1.操作简便，可以标准化，便于推广2.标本可评价率高3.检测敏感、可靠、客观4.具备产业化条件2.ATP生物荧光药敏检测技术的优点:敏感性好可检测最少10个细胞。而其他技术则一般需要500个细胞以上可评价率高标本可评价率在90%以上快速检测完成ATP检测仅需30分钟，而其它方法需1～4小时的孵育时间量程宽检测线性范围为10～100000个细胞/孔（96孔培养板）精密度好变异系数（CV）小于10%，在国家标准（10%）的范围内结果准确整体预测值为86%检测效率高同时动态检测评估化疗药物6个剂量下对肿瘤的杀伤作用高通量检测适合96、384、1536孔板检测分析自动化程度高实验数据计算机软件自动分析，分析结果直观可靠稳定性好具备产业化条件3.ATP-TCA技术原理：在有氧条件下,荧光酶（luciferase）可以催化荧光素（luciferin）释放出荧光（波长为562nm），同时ATP转变成AMP。所释放的荧光强度与胞内ATP含量呈正相关。细胞死亡后，胞内ATP迅速水解，而活细胞的ATP含量基本恒定。因此所测得的荧光强度反映了活细胞的数量。比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。ATP+Luciferin+O2AMP+2Pi+Photons+OxylaluciferinLuciferase荧光强度与活细胞数量的关系1001000100001000001000000100000001020408015831262512502500500010000200004000080000细胞数量(个/孔）荧光强度(RLU)r＝0.99864.技术流程TumorSingleCellsuspensionMechanicalandenzymaticaldissociationIncubationfor5-7daysAdditionofdrugs/mediumATP-LuminescenceATPextractionandstabilizationSoftwareEvaluationConstructionofdose-responseplots5.适用肿瘤类型6.适用肿瘤标本类型神经母细胞瘤黑色素瘤甲状腺癌结直肠癌乳腺癌卵巢癌胰腺癌肉瘤胃癌肺癌•实体瘤标本•胸腹水•活检淋巴结标本7.国内外研究历史回顾1.1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随后Kangas等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。2.自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。3.1998年，Kurbacher等人报道了ATP-TCA辅助化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明，ATP-TCA指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。4.NIH的GOG(GynecologicOncologyGroup)项目组认为ATP-TCA是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目(1998)。5.至今该技术的临床应用相关文献已有200余篇。6.国内尚无该技术产业化的报道。时间国家研究人肿瘤类型结论1988年美国SevinBU,PengZL卵巢癌阳性预测值：92%，阴性预测值：90%整体预测精确值：86%1990年日本JinushiK,Hirabayashi胃癌预测精确性为88.9%1993年瑞士KoechliOR,AvnerBP乳腺癌阳性预测值：90%，阴性预测值：86%整体预测精确值：85%1995年美、英、德三国协作AndreottiPECreeIA顺铂耐受卵巢癌整体预测精确值：92%1996年英国CreeIA,KurbacherCMIII/IV期乳腺癌整体预测精确值：76％1997年日本KawamuraH,IkedaK胃肠道肿瘤阳性预测值：64%，阴性预测值：100%整体预测精确值：84%2000年美国KonecnyG,CrohnsCFIGOⅢ期卵巢癌阳性预测值：66%，阴性预测值：89%敏感性：95%，特异性：44%2000年德国MollgardL,TidefeltU急性非淋巴细胞白血病阳性预测值：86%，阴性预测值：100%2001年美国O'MearaAT,SevinBU上皮性卵巢癌阳性预测值：83%，阴性预测值：56.5%ATP-TCA技术的临床相关性研究结果ATP-TCA与其它药敏检测方法的相关性ATP-TCA技术与DiSC法的相关性ATP-TCA技术与MTT法的相关性8.目前先进国家对该技术的评价1.1998年德国DCS公司将该技术产业化，并获得国际ISO质量评估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入。2.2001年，美国全国医疗保险协会(HealthMaintenanceOrganization)认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的先进技术，建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等6个州已获医疗保险赔付。3.2003年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进的临床医学项目，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。因此，ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感，可靠，具有极大的临床应用价值第二部分ATP-TCA药敏检测技术及质量标准的建立ATP-TCA技术的核心试剂1.荧光酶试剂热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可靠性，满足临床实际工作的需要2.培养基肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性下面我将就这两个核心试剂的研发汇报我所做的一些工作●荧光酶基因克隆、点突变、表达及纯化(2001,4－2001,10)●肿瘤细胞选择性培养基配方筛选及优化(2001,5－2001,12)●检测技术核心试剂的质量标准的建立(2002,1－2002,3)工作内容及进展自荧火虫体内发光腺体提取荧光酶mRNA逆转录为cDNA,PCR扩增，克隆构建重组质粒PET22b-luc设计点突变引物，定点突变荧光酶第245和215位氨基酸序列将含点突变PET22b-luc导入原核高效表达系统Ecoli-BL21筛选高表达株，高效稳定表达重组荧光酶通过蛋白工作站，纯化生产重组荧光酶制备冻干荧光酶制剂重组荧光酶研发路线荧光酶基因的克隆和鉴定PCR产物电泳图重组质粒PET22b-luc鉴定图野生型荧光酶基因编码序列(1653bp)M215：GC→AGAla→LeuM245：C→GHis→Glnatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgc*ctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcac*ggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctca