Southern&northern&western杂交原理

Southern杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。Northern印记杂交Northernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。