中国人原发性肺腺癌EGFR基因突变分析

摘要】目的探讨原发性肺腺癌表皮生长因子受体(EGFR)基因突变特点，及其与临床特征（性别、临床分期、吸烟情况）的关系。方法采用PCR扩增和基因测序，检测133例原发性肺腺癌EGFR外显子18，19，20和21的突变情况，同时分析其突变与临床特征的关系。结果133例中检测到EGFR基因突变50例（37.6%，50/133），EGFR基因突变与性别和吸烟史相关，与临床分期无关。结论使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗前进行EGFR基因检测非常必要。【关键词】EGFR；肺腺癌；基因突变表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一种受体型酪氨酸激酶，在许多肿瘤中过表达和(或)发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切的关系〔1〕。已知EGFR的突变是治疗非小细胞肺癌的重要因素，很多医药公司研究出了EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitors，TKI）的药物，以gefitinib和erlotinib为代表，在非小细胞肺癌，特别是在肺腺癌的治疗中显示出很好的抗肿瘤的疗效〔2，3〕。EGFR的基因突变作为使用药物是否有效的一个重要因素。直到最近的研究发现，EGFR的基因突变仍存在于外显子18～21，不同外显子的突变将导致构象变化，改变和增强蛋白的活性，同样增强对TKI的敏感性〔4～6〕。TKI通过与ATP竞争结合EGFR胞内酪氨酸激酶区，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤增殖、转移、血管生成等一系列肿瘤细胞生物活动。本研究通过检测肺腺癌患者EGFR的突变情况，以及与临床特征之间的关系，为筛选最合适的病人进行有针对性的靶向治疗提供依据，以避免不合理用药。1材料与方法1.1材料收集吉林大学第一医院胸外科手术切除原发性肺腺癌的石蜡包埋组织标本133例，其中男∶女＝72∶61。TNM分期（Ⅰ～Ⅳ）：Ⅰ期（T12N0M0）55例，Ⅱ期（T12N1M0，T3N0M0）39例，Ⅲ期（T4N0M0，任何TN3M0）31例，Ⅳ期（任何T任何NM1）8例。根据吸烟史分为：有吸烟史63人，无吸烟史70人。1.2方法石蜡包埋的组织切片，切除组织周围多余石蜡后，将组织切片放入1.5ml的Eppendorf管中；加入1ml二甲苯，微微摇动，换液3次，总时间约12h；用不同浓度乙醇梯度水化，离心，用TE浸洗1次，30min，离心弃上清。一次加入TE200μl，10%SDS20μl，蛋白酶K（10mg/ml）3μl，37℃过夜；使用ToyoboDNA抽提试剂盒抽提经消化的组织。离心分离，室温，吸上清约100μl转入新Eppendorf管中。样品上清液中加入750μl溶解吸附液，40μl磁珠，旋涡混合器震动10min，置管于磁性台架30s使磁珠聚集然后去除上清液，Eppendorf管中添加900μl洗净液，使用旋涡混合器剧烈震荡5s，使磁珠均匀分散开；置管于磁性台架30s使磁珠聚集，去除上清液，加入100μl灭菌水，旋涡混合器剧烈震荡10min；聚集磁珠，然后将含有DNA的上清液回收至新的1.5mlEppendorf管中；0.8%琼脂糖电泳，检验DNA质量。PCR方法扩增EGFR基因外显子18、19、20和21，引物序列分别为18上游：ggcgtggaaacagacatagaa，下游：tggagtttcccaaacactcag；19上游：attcgtggagcccaacag，下游：gccagtaattgcctgtttcc；20上游：ctctcccactgcatctgtca，20下游：gatgggacaggcactgatt；21上游：gtcagcagcgggttacatct，21下游：aagcagctctggctcacact。具体操作方法按照试剂盒(Takara)说明书进行。最后在ABI3730测序仪上机测序。1.3统计学方法SPSS13.0软件进行χ2检验。2结果2.1EGFR基因突变特点在133例肺癌标本中，共检测到EGFR基因突变50例（37.6%，50/133）。其中外显子18检测到EGFR基因突变2例；外显子19检测到EGFR基因突变32例；外显子20检测到EGFR基因突变2例；外显子21检测到EGFR基因突变8例；外显子19和外显子21同时EGFR基因突变4例，外显子19同时2处EGFR基因突变的2例。在外显子19所检测到32例EGFR基因突变中共有9种不同的突变形式，最常见核苷酸缺失起始位为2235（23例）和2238（8例），而核苷酸缺失终止位为2249（27例）。在外显子21所检测到12例EGFR基因突变中，其位点为2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸（CTG→CGG，L858R）的为11例，第861外显子的2828位点T由A取代的为1例，导致第861位框架氨基酸变为L861Q。在外显子20所检测到2例EGFR基因突变位点为2361位的G由A取代，导致第787位框架氨基酸变为Q787Q。外显子18检测到的2例均为2170位的G被A取代，使得第724位框架氨基酸变为G724S。外显子19和外显子21同时EGFR基因突变4例中，第22352258位点缺失同时EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸（CTG→CGG，L858R）的为2例，还有第22382252位点缺失同时和第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸（CTG→CGG，L858R）的为2例。外显子19同时2处EGFR基因突变的2例均为第22382249位点和第22372251位点同时缺失。见表1。表1EGFR基因突变特点（略）2.2EGFR基因突变与临床特征的关系男女EGFR基因突变发生率分别为29.2％（21/72）、47.5％（29/61），二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。无吸烟史者EGFR基因突变发生率为47.1％（33/70）；有吸烟史者为27.0％（17/63），二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。TNM分期Ⅰ期EGFR基因突变发生率为34.5％（19/55）；Ⅱ期为38.5％（15/39）；Ⅲ期为41.9％（13/31）；Ⅳ期为37.5％（3/8）。组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。表2EGFR基因突变与临床特征关系（略）3讨论Lynch等〔4〕和Paez等〔5〕首先报道了位于EGFR酪氨酸激酶编码区第18～21外显子的突变与gefitinib的有效率明显相关。实验证实EGFR基因突变能导致细胞功能改变，Lynch等发现导入de1747～753InsS和L858R的cos7细胞与具有野生型EGFR的细胞相比，EGFR蛋白的表达水平相当，加入EGF后EGFR变异体的磷酸化程度更高，持续时间更长。Paez等〔5〕发现携带L858R的H325S细胞对gefitinib的敏感性比野生型细胞高100倍；gefitinib不但抑制EGFR自我磷酸化，还抑制EGFR下游分子ERK1/2和AKT激酶的磷酸化。EGFR基因共28个外显子.其中编码酪氨酸激酶区的是第18～21外显子。对EGFR基因突变的数据分析表明，尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区，但89％的突变集中在第19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变〔7〕。本次实验中突变也主要集中在19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变，与文献报道相似。实验证实有功能的突变EGFR是一种糖蛋白的跨膜受体，是酪氨酸激酶生长因子受体家族的成员。一旦EGFR胞外部分与配体相结合，就会在细胞表面形成受体同源二聚体或异源二聚体。EGFR最常见的异源二聚体化类型是Her2。该二聚体化改变了受体的构象，导致受体胞内结构的特定酪氨酸残基自身磷酸化，激活其下游信号途径，将外界信号转导至细胞内〔2〕，这种变异的基因被转染到细胞后，提高了细胞对EGF的反应性，也明显增加了对gefitinib的敏感性。Lynch等〔4〕认为这种现象可能是由于EGFR变异使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些关键基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂gefitinib的相互作用。因此，有变异EGFR基因的患者表现出对gefitinib更好的治疗反应。Paez等〔5〕率先分析了119例NSCLC患者的突变与临床特征的关系，发现EGFR突变发生率在腺癌中高于其他病理类型，女性高于男性。此次实验全部选择原发性肺腺癌患者，结果男性EGFR基因突变发生率明显低于女性，与Paez等人的结果相符。美国非小细胞肺癌的患者中只有约10％有EGFR的基因突变，然而在亚洲人中，约30％的非小细胞肺癌患者有EGFR的基因突变〔8，9〕，本的实验EGFR突变率为37.6％，高于非小细胞肺癌的平均突变率，这也说明在中国人腺癌中的突变率高于其他病理类型的突变率，而且明显高于欧美人。Pao〔10〕等发现不吸烟NSCLC患者的EGFR突变率高于既往吸烟的患者，本研究中，无吸烟史病例EGFR基因突变发生率为47.1％，也明显高于有吸烟史者，与有些文献报道一致。本研究也发现EGFR的基因突变与临床分期无关，这与很多报道是相似的。以EGFR受体酪氨酸激酶为靶点抗肿瘤药物已经成为晚期肺癌治疗的一种新选择。由于NSCLC中EGFR基因突变与TKIs治疗敏感性显著相关，临床上应根据EGFR突变情况来选择用药。综上所述，肺癌组织存在EGFR突变预示了其对EGFR－TKI的敏感性。分子靶向依赖性和对病人的个体化治疗是优化肺癌分子治疗的中心，对患者的EGFR基因测序是选择合理化治疗的关键，这种方法可以避免假阴性，也避免患者因使用无效的药物而承担的医疗费用和耽误治疗时间。随着研究的深入，可以预期EGFR的基因检测技术将会不断完善，最终成为临床上的一项常规诊断项目，用于临床筛选靶向治疗有效的患者，更好的为患者提供治疗方案。【参考文献】1金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮158例疗效观察[J];广东医学;1997年10期2董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮126例[J];中国中医药科技;1999年06期3查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会[J];江西中医药;年05期4张随学,谭正辉,孙叶梅,李梅,俞玉芳,韩峰;3003例痤疮患者特征分析与控制对策[J];中华医学美学美容杂志;年06期5刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗[J];临床医药实践杂志;2003年09期6高宜云;痤疮从肝论治[J];中医药临床杂志;2004年03期7欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮[J];中华皮肤科杂志;2004年09期8陈五一;;痤疮辨治体会[J];世界中医药;年03期9雷放;中药热敷治疗痤疮有效[J];新中医;年09期10李东华;异维生素A酸治疗痤疮[J];新医学年10期11黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察[D];南方医科大学;2011年12陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究[D];广州中医药大学;2011年13陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究[D];广州中医药大学;2010年14HamidAbdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白27、60、65、70的影响[D];北京中医药大学;年15陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究[D];广州中医药大学;2009年16张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究[D];复旦大学;2005年17庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关