NSFCproposal-30370577(CaSR)

学科代码：C030204受理部门：收件日期：受理编号：检查保护(P)国家自然科学基金申请书资助类别：面上项目亚类说明：自由申请项目附注说明：本课题是在我们首次发现大鼠心肌细胞存在钙敏感受体（国际合作研究课题）的基础上，继续深入研究。项目名称：大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用申请者：徐长庆电话：[phone]依托单位：哈尔滨医科大学通讯地址：哈尔滨市南岗区保健路157号邮政编码：150086单位电话：[phone]E-mail：[e-mail]申报日期：2003年2月18日国家自然科学基金委员会您现在还不能填写文档或打印，请根据以下三个步骤操作：1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中方法:Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中(如果您是Word97用户，继续执行以下步骤)2)关闭本文档，重新打开本文档3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了国家自然科学基金申请书第2页共28页基本信息申请者信息姓名徐长庆性别男出生年月1945年4月民族汉族学位学士职称教授主要研究领域心肌缺血/再灌注损伤的机制和保护电话[e-mail]传真[phone]个人网页工作单位哈尔滨医科大学\基础医学学院病理生理教研室在研项目批准号依托单位信息名称哈尔滨医科大学代码15008601联系人刘凤玉[e-mail]电话[phone]网站地址合作单位信息单位名称代码[在此录入修改][在此录入修改][在此录入修改]项目基本信息项目名称大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明本课题是在我们首次发现大鼠心肌细胞存在钙敏感受体（国际合作研究课题）的基础上，继续深入研究。学科代码C030204:病理生理学C010402:生物膜的结构与功能基地类别预计研究年限2004年1月—2006年12月研究属性基础研究总预算经费申请经费摘要项目研究内容和意义简介（限400字）：1)钙敏感受体在大鼠心肌组织的分布和正常生理作用。2)心肌缺血/再灌注对大鼠心肌组织钙敏感受体表达的影响。3)钙敏感受体激活与再灌注心律失常发生的内在关系。4)钙敏感受体激活引起心肌细胞内游离钙浓度增加的机制及信号传导途径。在我们已证实其机制是通过PLC-IP3的基础上，进一步是通过百日咳毒素敏感性G蛋白，还是通过非百日咳毒素敏感性G蛋白，或是两种方式均有。同时把有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸激酶途径作为观察重点。5)探讨钙敏感受体激活引起心肌细胞发生钙振荡，钙波和“钙爆炸”的特点，规律和机制，揭示钙敏感受体激活在心肌缺血/再灌注损伤中作用。关键词(用分号分开，最多5个)钙敏感受体；心肌；大鼠；精胺；钙爆炸国家自然科学基金申请书第3页共28页项目组主要成员编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话E-mail项目分工每年工作时间（月）1徐长庆1945年4月男教授学士哈尔滨医科大学[e-mail]项目负责人102WangRui(王睿)1956年11月男教授博士加拿大萨斯卡彻温大学(306)[e-mail]技术指导及部分实验13张伟华1972年1月女讲师硕士哈尔滨医科大学[e-mail]分子生物学检测124赵雅君1964年7月女高级实验师硕士哈尔滨医科大学[e-mail]心肌精胺代谢与功能125张艳桥1963年2月女副教授硕士哈尔滨医科大学[e-mail]信号传导途径126时飒1980年11月女助教硕士哈尔滨医科大学[e-mail]膜片钳实验87李弘1976年5月女讲师硕士哈尔滨医科大学[e-mail]分子生物学检测88李全凤1976年1月女高级实验师硕士哈尔滨医科大学[e-mail]细胞培养和激光共聚焦69韩丽萍1982年5月女硕士生硕士哈尔滨医科大学[e-mail]激光共聚焦1010张红雨1984年12月男硕士生学士哈尔滨医科大学[e-mail]生化测定12总人数高级中级初级博士后博士生硕士生16321244说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明:2.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入。国家自然科学基金申请书第4页共28页经费预算(单位:万元)科目预算金额备注（计算依据与说明）一．研究经费27.00001．科研业务费7.0000（1）测试/计算/分析费2.5000心肌钙敏感受体mRNA测序，引物合成，电镜检测费等（2）能源/动力费0.5000水电费等（3）会议费/差旅费2.0000会议费：0.4×3人次，科研调研旅差费0.8（4）出版物/文献/信息传播事务费2.0000国内外论文发表费1.2,文献资料费0.3,信息传播事务费0.2,各种评审评奖费0.3（5）其他0.00002．实验材料费14.0000（1）原材料/试剂/药品购置费12.0000分子生物学、激光共聚焦、膜片钳、高效液谱仪等检测用各种kit，胶原酶，萤光探针，离子通道和信号传导通路阻断剂等，（2）其他2.0000高效液谱仪分离柱和流动相，高纯CO2气,混合气，进口微量可调加样器，玻璃吸管、高容积ZIP软盘等3．仪器设备费1.0000（1）购置1.0000微量控温灌流装置（2）试制0.00004．实验室改装费1.0000膜片钳防震台改装等5．协作费1.00006．其他0.0000二．国际合作与交流费3.00001．项目组成员出国合作交流1.0000项目组成员1人次去加拿大萨斯卡测温大学WANGRui教授实验室短期研究的国际旅费2．境外专家来华合作交流2.0000加拿大WANGRui教授来华短期工作来往交通费和生活费三．劳务费2.0000研究生劳务生活补助025×8人年四．管理费1.0000五．其他0.0000经费总预算33.0000申请经费28.0000其他经费来源（单位：万元）自然科学基金其他项目资助经费0.0000国家其他计划资助经费0.0000其他经费资助（含部门匹配）5.0000合计5.0000国家自然科学基金项目申请书第5页共28页报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。（1）国内外研究现状及分析；钙敏感受体(Calcium-sensingreceptor，CaSR)是一种G蛋白偶联受体，其主要激活剂是细胞外钙。1993年﹐BrownEM等人首次从牛甲状旁腺克隆出CaSR，论文在Nature上发表【1】。目前﹐钙敏感受体的研究已成为国际研究热点。国际著名数据库Medline收录涉及CaSR的论文多达7千余篇。国内基本尚未起步，中国著名万方数据资源系统(中国数字化期刊)仅收录1篇有关钙敏感受体的文章（“慢性肾功能衰竭甲旁亢大鼠甲状旁腺钙敏感受体改变”）【2】。CaSR属于G蛋白偶联受体超家族中的C家族（mGluR、GABAB受体和信息素受体也是该家族成员）。哺乳动物、鸟、两栖动物、爬虫动物和鱼类均有CaSR【3】。CaSR有3个主要区域：1)氨基端的细胞外区(ECD)：含多个糖基化位点﹐细胞外Ca2+或其它配体结合于此区，大多数激活和失活突变多发生该区；2)跨膜区(TMD)：7个跨膜区(此为G蛋白偶联受体的特征)和3个细胞内环；3)细胞内COOH端尾部。在细胞内环和COOH尾﹐有PKC和PKA的磷酸化位点【3，4】。判断某组织是否存在CaSR，可通过分子生物学和功能性检验：(1)[Ca2+]o增加可引起[Ca2+]i增加；(2)内钙增加来源于钙库动员；(3)外钙内流(经非电压敏感性通道)；(4)Gd3+和Ca2+是激动剂；(5)CaSR转录和表达的存在(用PT-PCR，免疫组化，northernblot,westernblot等证实)【5】。CaSR激活引起细胞内钙增加的主要机制是细胞内钙库动员(ER或SR)。绝大多数CaSR→G蛋白介导的第二信使系统→钙动员增加→[Ca2+]i迅速升高(激活PLC-IP3[促使内钙释放]；DAG[激活PKC，开放电容性钙通道，外钙内流])【3，5】。近年来，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸激酶在CaSR信号传导中的作用开始受到重视【6】。CaSR除分布在参与机体钙稳态调节的甲状旁腺、肾脏、甲状腺C细胞、肠道上皮细胞、成骨细胞和破骨细胞外，也广泛表达在中枢和周围神经系统、胃、食道、肝、胰腺、水晶体、脑垂体、骨髓和外周血、乳腺和动脉平滑肌细胞等【3，5，7－16】。CaSR的功能主要是维持机体钙和其它金属离子稳态，同时在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程中亦发挥重要作用【3，5，11，12，17】。CaSR基因的激活突变，可引起家族性低钙尿性高钙血症(FHH)和新生儿严重甲状旁腺机能亢进(NSHPT)。失活突变，可见于常染色体显性甲状旁腺功能减退症(ADHH)和家族性低血钙症【3，5】。CaR已成为治疗因CaR活性过强或低下所致疾病的新靶点。尽管钙敏感受体已成为研究热点，但在心肌细胞是否存在CaSR，迄今未见报道。只有一篇论文提到该室在进行大鼠肾脏CaR克隆时未在心肌细胞测出CaR的表达【14】。去年﹐项目申请人徐长庆教授接受加拿大萨斯卡彻温大学医学院RuiWang教授的邀请﹐在其实验室开展合作研究。该室用分子生物学方法证实,大鼠心肌细胞有CaR的mRNA和蛋白表达的存在（见附图一）。徐长庆教授用Fura-2作为钙离子荧光探针﹐从机能学角度加以确定。实验表明﹐[Ca2+]o浓度增加及其它CaR激动剂，如Gd3+﹐spermine等，可引起大鼠心肌细胞内游离钙增加，在阻断Na-Ca交换和L-型钙通道的情况下亦然。但磷脂酶C(PLC)的抑制剂(U73122)和肌浆网（SR）钙泵抑制剂(thapsigargin)则可明显降低或取消CaR激动剂所致细胞内钙的增加。这说明在大鼠心肌细胞确实存在CaSR,其导致细胞内钙的机制是通过PLC-IP3通路引起SR内钙释放。这两方面实验结果整合到一篇论文，投往著名国际性杂志，徐长庆教授是并列作者(并署名单位－哈医大)。我们的工作是有关心肌细胞存在钙敏感受体的首例报道。国家自然科学基金项目申请书第6页共28页A.ThedetectionofCaSRmRNAbyRT-PCRinratheartinthepresenceorabsenceofreversetranscriptase(RT).M,DNAmarker;B.ThedetectionofCaSRproteinsbyWesternblotinratheartusinganti-CaSRantibody.C.ThefailuretodetectCaSRproteinsbyWesternblotinratheartintheabsenceofanti-CaSRantibody.ImmunohistochemicaldetectionofCaSRinratcardiactissuesTissuesectionsofratliver(A-C)andratheart(D-F)wereprocessedinthepresence(A,B,DandE)orabsenceofanti-CaSRantibod