诊断分子生物学基本技术

诊断分子生物学基本技术诊断分子生物学基本技术基础知识实验基础诊断技术临床应用amprΒ半乳糖苷酶N端编码序列变性与复性（denaturationandrenaturation）变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即变性增色效应解链过程中，DNA的A260增加，并与解链温度有一定的关系，这重关系称为DNA的增色效应复性变性DNA在适当的条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象即复性退火热变性的DNA经缓慢冷却即可复性，这一过程称为退火解链温度Tm(meltingtemperature)解链曲线在连续加热DNA过程中，以温度对A260的关系作图，所得曲线称为解链曲线解链温度Tm在解链曲线中，紫外线吸收值达到达50%时的温度为Tm。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被打开Tm的影响因素碱基组成与G+C比例有关，G+C比例越高，Tm值越高实验条件例如三氯醋酸存在使Tm变小，氯化钠存在使Tm升高基因载体（genevector）概念把目的基因导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。特点自我复制遗传标记插入位点种类质粒噬菌体病毒DNA连结酶（DNAligase）概念连接DNA链3`-OH末端和相邻DNA链的5`-P末端，生成磷酸二酯键而形成完整的DNA链种类T4噬菌体DNA连结酶T4噬菌体RNA连结酶大肠E.coliDNA连结酶作用连接粘端连接平端目的基因（targetgene）概念需要研究的基因叫目的基因。来源基因文库存在于转化菌内、由克隆载体所带的所有基因组DNA的集合。化学合成法用DNA合成仪利用化学原理合成该核苷酸序列。cDNA以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA。聚合酶链反应在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA。核酸的分离与纯化（theseparationandpurificationofnucleicacid）细胞的溶解因标本而异用SDS、Tritonx-100、超声破碎等核酸的分离苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，将核酸分离核酸的提取冷乙醇或异丙醇沉淀核酸，离心回收核酸去除杂质70%的乙醇洗涤沉淀，除去处多余的盐类核酸探针的标记（thelabellingprobeofnucleicacid）概念对已知碱基序列的单链核酸用示踪物进行标记得到核酸探针示踪物分类放射性核素类优点：灵敏度高、特异性高、不影响酶促反应。缺点：污染环境、损害人体。非放射性核素类抗原抗体免疫标记物地高辛、亲和配体标记物生物素、荧光标记物FITC、电子密度标记物胶体金等。标记方法缺口平移法随机引物法末端标记法缺口平移标记法（Thelabelmethodofnicklevelmoving）概念由DnaseⅠ在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5`端核苷酸和3`端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链，合成与模板互补的新链。优点快速、简便、成本相对低、比活性较高、标记均一，大分子标记效果好（﹥1000bp）。缺点单链DNA、RNA、﹤200bp不能用该法标记。﹤随机引物标记法(Thelabelmethodofrandomprimer)概念采用6个核苷酸的随机引物与模板DNA结合的原理将标记物掺入到新合成的DNA片段中去，完成探针标记反应。随机引物是指有各种可能排列组合顺序的混合物，能与任何核酸序列退火杂交，并为DNA聚合酶的反应起到引物作用。方法将双链DNA变性为单链，与随机引物退火杂交，在含有dNTP底物的示踪物的存在下，由Klenow片段催化下，从引物3`末端开始按5`-3`方向合成新的互补DNA链，即标记的DNA探针。优点具有缺口平移标记法的优点，而且能标记任何长度的DNA及RNA。末端标记法（Theend-labellingmethod）概念用核酸修饰酶对核酸片段的5`或3`末端进行部分标记，不对全长标记。分类Klenow片段末端标记法在有标记的dNTP存在下，Klenow片段可以填充双链DNA凹陷的3`末端，获得标记的DNA探针。T4DNA聚合酶置换合成标记法利用T4DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶和5`-3`核酸内切酶的作用，使3`末端凹陷，加入有标记的dNTP，获得标记的DNA探针，用于末端为3`突出粘端和平端的情况。T4多聚核苷酸激酶标记法T4多聚核苷酸激酶可将[γ-32P]ATP的[γ-32P]转移到DNA游离的5`-OH上，还可催化γ-32P与5`末端的磷酸基团交换，因此无论是否5`末端去磷酸均可用此法标记。分子生物学实验诊断技术核酸扩增技术核酸杂交技术多态性的分析核酸序列分析DNA重组技术杂交核酸技术（Thehybridizationtechniqueofnucleicacid）核酸分子杂交在DNA复性过程中，如果把不同的DNA单链分子或者把DNA与RNA放在一起，只要存在碱基配对关系，就可以在不同分子间形成杂化双链，这种分子现象为核酸分子杂交核酸杂交技术利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。分类斑点杂交用于基因组DNA或RNA的分析Southernblot用于基因组DNA的分析Northernblot用于以知mRNA表达水平的分析原位杂交细胞内杂交，用于DNA或RNA的分析Southernblot（1）概念用转膜法进行DNA杂交分析步骤提取消化提取基因组DNA并将其经限制性内切酶消化成片段电泳将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性使其成为单链转膜将硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中DNA片段转移到NC膜上杂交此杂交膜在杂交液中与探针杂交显影用放射自显影显示出杂交分子带Southernblot（2）重物吸水纸滤纸凝胶缓冲液Northernblot概念用转膜法进行RNA杂交分析步骤提取总RNA的提取电泳将RNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性，防止发夹状结构形成转膜NC膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中RNA片段转移到NC膜上杂交此杂交膜在杂交液中与DNA探针杂交显影用放射自显影显示出杂交分子带注意所用试剂均用0.1%DEPC水配制注意所有器具均需高温处理斑点杂交（dothybridizationtechnique）概念核酸与探针直接在NC膜上杂交的方法步骤提取提取DNA或RNA样品点样样品点在NC膜上，烘烤使其固定在膜上杂交将膜、探针、杂交液封入杂交袋中，杂交显影用放射自显影显示出杂交分子点原位杂交（insituhybridization）概念保持细胞形态，在细胞内进行核酸杂交步骤固定标本涂片或组织切片置微波炉中照射，固定标本杂交将探针（常用生物素标记法）复盖在标本上，加入杂交液，杂交显色载玻片放入缓冲液中，加入底物，显色。摄影显微镜下观察结果，摄影核酸杂交技术与基因诊断Ⅰ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅠ）限制性内切酶酶谱分析法概念利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因突变原理当待测DNA序列发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其片段的长度与数量在电泳迁移率上会随之改变。借此做出诊断应用检测基因突变的位点与数量核酸杂交技术与基因诊断Ⅱ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅡ）DNA限制性片段多态性分析（RELP）概念DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该片段会产生长度不同的片段，此片段为遗传标志，检测致病基因的带者原理在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对突变（称为中性突变），中性突变导致个体间的差异，叫DNA多态性。在某家族中，致病基因与特异多态性紧密连锁，此多态性为遗传标志应用遗传病的基因诊断核酸杂交技术与基因诊断Ⅲ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅢ）等位基因特异寡核苷酸探针杂交概念根据已知遗传病基因突变的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探针（突变与正常），分别与受检者杂交，判断其为突变的纯合子、杂合子、新的突变类型或正常原理若受检者只与突变探针杂交，则为突变纯合子；若与两种探针杂交，则为突变杂合子；若与正常探针杂交，则不存在该突变基因；若与两者均不杂交，提示新的突变。聚合酶链反应PCR（polymerasechainreaction，PCR）概念用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段原理以待扩增的DNA为模板，以一对与模板5`和3`末端互补的寡核苷酸片段为引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，合成新链，反复重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。基本步骤变性95℃使模板DNA完全变性为单链应退火较Tm低5℃，使引物与模板DNA退火结合延伸72℃DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应PCR与基因诊断（PCRandgenediagnosis）目的基因的克隆（模板为cDNA或基因组）利用特异性引物获得已知的目的基因利用简并引物获得同源性的基因片段利用随机引物随机克隆基因基因的体外突变可以随机设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造DNA的微量分析病原微生物的微量检测突变基因的筛选法医学的鉴定DNA序列分析PCR引物的设计（ThedesignofPCRprimer）长度以扩增片段而定，一般15—30个碱基，引物越长，特异性越强碱基GC含量以45%—55%为佳，GC应随机分布Tm值Tm值应底于延长温度引物内和引物间不宜形成二级结构特异性特异性强，不扩增目的基因以外的DNAPCR扩增条件的设计（ThedesignofPCRextensioncondition）退火一般Tm－5℃，与目的基因长度有关，目的基因短，退火温度可底，时间可短。退火温度太高，有时会得不扩增产物，退火温度太低，容易得不到产物延伸与目的基因长度有关，一般认为DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.时间太短，会得不到产物，时间太长，会出现Smear.扩增次数扩增次数太少，扩增量不足，扩增次数太多，提高灵敏度，易造成非特异性扩增，会出现Smear.引物引物过多，易出现双引物聚合，电泳出现小于100bp的带，引物过少，扩增量少。PCR技术探讨（TheinvestigationofPCRtechnique）ⅠSmear现象原因酶量过多变性时间过短变性温度过低dNTP量过少延伸时间过长循环次数过多模板量过多建议0.5U递减变性时间5秒递增变性温度0.5℃递增50um递增10秒递减2个循环递减模板量20%递减PCR技术探讨（TheinvestigationofPCRtechniqueⅡ非特异性扩增原因引物浓度过高引物设计不合理酶量过多循环次数过多变性温度过低延伸时间过短模板量过多建议0.1um递减改变引物位置与长度0.5U递减2个循环递减2℃递增10秒递增酶量20%递减单链构象多态分析技术（Theanalysistechniqueofsinglestrandconformationalpolymorphism）概念由DNA单链构象所决定迁移率的电泳技术原理在中性聚丙烯凝胶电泳时，DNA单链的迁移率除与长短有关，更取决于DNA自身折叠形成的由碱基顺序决定的构象，甚至单个碱基不同，迁移率就不同，因此检测出含有基因突变的DNA或RNA片段特点这项技术具有简便、快速、敏感、和经济等特点，适用于大样本基因变异的筛查SSCP技术的应用（TheapplicationofSSCPtechnique）适用于大样本基因变异的筛查用于癌基因和抗癌基因突变的检测DNA多态性分析复等位基因的分析遗传病的致病基因分析基因制图SSCP技术流程（TheprocedureofSSCPtechnique）总RNA的提取逆转录合成cDNAPCR特异扩增目的