SN 1135.6-2008马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１３５．６—２００８马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犲狉狔狋犺狉狅狊犲狆狋犻犮犪犘犲狋犺狔犫狉犻犱犵犲２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１１３５共分为六个部分：———马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；———马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；———马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；———马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；———马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；———马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法。本部分是ＳＮ／Ｔ１１３５的第６部分。本部分的附录Ａ、附录Ｂ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：曹云华、周力兵、蒋小龙、丁元明、寸东义、杜宇、刘忠善、和捷。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１１３５．６—２００８马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法１　范围ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分规定了马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法。本部分适用于马铃薯中绯腐病菌的检疫和鉴定。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＳＮ／Ｔ１１３１—２００２　大豆疫霉病菌鉴定方法３　原理马铃薯绯腐病菌（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犲狉狔狋犺狉狅狊犲狆狋犻犮犪Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ）属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ），腐霉目（Ｐｙｔｈｉａｌｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪）。该病菌是世界马铃薯种植地区一很严重的病菌，它主要以卵孢子在土壤中存活，存活期至少７年，受侵染的种薯和种薯上附着的土壤是远距离传播的初侵染源。该病原菌的为害症状、孢子囊和卵孢子的形态特征是鉴定该病菌的依据。４　仪器、设备４．１　多功能显微镜（含照相装置、测量及显示器）。４．２　体视显微镜。４．３　恒温恒湿培养箱。４．４　光照培养箱。４．５　高压灭菌器。４．６　超净工作台。４．７　普通天平（感量１／１００）。４．８　电子天平（感量１／１０００）。４．９　干热灭菌箱。４．１０　普通冰箱。４．１１　－２０℃低温冰箱。４．１２　培养皿（直径９ｃｍ）。４．１３　三角烧瓶（１０００ｍＬ，５００ｍＬ，２５０ｍＬ，５０ｍＬ）。４．１４　载玻片（２５ｍｍ×７５ｍｍ，厚０．８ｍｍ）。４．１５　盖玻片（１８ｍｍ×１８ｍｍ）。４．１６　Ｐａｒａｆｉｌｍ膜或铝铂纸。４．１７　冻存管（１．８ｍＬ，５．０ｍＬ）。５　试剂５．１　次氯酸钠溶液。５．２　碳酸钙。１犛犖／犜１１３５．６—２００８５．３　琼脂粉。５．４　琼脂糖。５．５　匹马霉素。５．６　万古霉素。５．７　阿莫西林。５．８　利福平。５．９　制霉菌素。５．１０　五氯硝基苯。６　培养基６．１　基础培养基黑麦番茄汁琼脂培养基、Ｖ８培养基（Ｖ８Ａ），其配制方法及步骤参见第Ａ．１章。６．２　选择性培养基使用玉米琼脂粉加抗菌素培养基（Ｐ１０ＶＰ＋）或加抗菌素的黑麦番茄汁琼脂培养基，在此培养基上培养的疫霉菌菌丝，再转移到Ｖ８培养基上可促进藏卵器的形成。配制方法参见第Ａ．２章。６．３　液体培养基使用豌豆液体培养基，其配制方法及步骤参见第Ａ．３章。７　检疫鉴定方法７．１　症状检查马铃薯绯腐病菌侵染的种薯有弹力，但不软腐似海绵状。受侵染组织易被细菌性软腐病菌感染而产生软腐。块茎末端或附近出现粉红的腐烂。侵染的块茎用水清洗后，病健交界明显。切开表面暴露在空气中２０ｍｉｎ会变成粉红色，随后由于氧化而变成黑色或紫褐色。这些颜色变化也和细菌性软腐相关，但绯腐病菌常常有氨的刺激性气味。地下马铃薯组织如根，匍匐茎，块茎和茎基都会受到侵染。手压侵染块茎，有汁液流出，不能恢复到原来的形状。７．２　分离方法７．２．１　将现场收集的土样称量，每份样１０ｇ碾碎放入５０ｍＬ的灭菌洁净烧杯中。加入适量的灭菌蒸馏水，使土壤呈饱和湿润状态，但避免出现流水，然后用ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口保湿，也可用无色透明塑料袋保湿。并将土样置于２２℃～２６℃，光照条件下４ｄ～６ｄ。７．２．２　在处理好的土壤中加入１０ｍＬ～１５ｍＬ蒸馏水，水面距土表１．０ｃｍ～１．５ｃｍ，然后可放入０．６％次氯酸钠处理过的马铃薯叶片（直径６ｍｍ）或番茄幼苗（在经过灭菌的蛭石里生长４星期）诱集。７．２．３　马铃薯叶片诱集４８ｈ～７２ｈ后取出，在灭菌纸上晾干，然后在Ｐ１０ＶＰ＋或加抗菌素的黑麦番茄汁培养基上培养；２４ｈ后用无菌的镊子把番茄幼苗水面位置的茎掐掉，使其受伤。４８ｈ～７２ｈ后，取出幼苗，在灭菌纸上放干，将其放在Ｐ１０ＶＰ＋或加抗菌素的黑麦番茄汁培养基中２２℃～２５℃做进一步培养。７．２．４　在无菌操作台上，从块茎内部坏死区域边缘切１０ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍ的小块，用０．６％次氯酸钠表面消毒３０ｓ，用无菌水冲洗两次，放在无菌滤纸上晾干，然后将其放在１．５％水琼脂（９ｍｍ培养皿）在２２℃黑暗下培养３ｄ～４ｄ，然后用无菌环将边缘旺盛生长的菌丝尖移植到Ｖ８培养基或黑麦番茄汁培养基中作纯化培养。８　鉴定特征马铃薯绯腐病菌的菌丝很整齐，最大直径可达７μｍ，水中悬着的菌丝呈圆形或多角形。孢子囊水中产生，形状变化大，椭圆形或倒梨形，中部常缢缩。孢囊孢子４３（～４７）μｍ×２６（～６９）μｍ，无乳突，顶２犛犖／犜１１３５．６—２００８端加厚不明显，具有内层出现象。培养形成的藏卵器大小为３０～３５（～４６）μｍ，壁光滑，厚１μｍ。雄器穿雄生，椭圆形或多角形，１４（～１６）×１３μｍ。卵孢子填满了藏卵器，壁厚２．５μｍ。形态特征图参见附录Ｂ。９　结果评定如马铃薯块茎感染症状符合７．１的相应症状、分离培养的病原菌特征与第８章描述特征吻合，鉴定为马铃薯绯腐病菌。１０　菌株的保存可将菌丝移到Ｖ８或黑麦番茄汁斜面培养基上，放入４℃冰箱中保存；也可将分离到的菌丝移入豌豆汤培养基中，在２５℃下生长１星期，然后倾去培养液，把菌丝放入冻存管在－２０℃保存。３犛犖／犜１１３５．６—２００８附　录　犃（资料性附录）基础培养基、选择性培养基和液体培养基的配制方法犃．１　基础培养基犃．１．１　黑麦番茄汁培养基１２０ｇ黑麦加水浸提３６ｈ，用纱布过滤，滤液备用，过滤后的黑麦再加水，放于５０℃中浸提３ｈ，用纱布过滤并挤压，过滤干净，滤液备用；量番茄汁１５０ｍＬ和黑麦滤液４５０ｍＬ混合，加水至１０００ｍＬ，加琼脂１７ｇ，碳酸钙（ＣａＣＯ３）１．２ｇ，调ｐＨ值至７．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。犃．１．２　犞８培养基３００ｍＬＶ８汁，１７℃４０００犵离心２０ｍｉｎ，上清液与碳酸钙（ＣａＣＯ３）１．２ｇ，琼脂１５ｇ混合，加无菌水至１０００ｍＬ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。犃．２　选择性培养基犃．２．１　犘１０犞犘＋培养基Ｄｉｆｃｏ玉米粉琼脂１７ｇ，４００μＬ匹马霉素，０．２ｍｇ万古霉素，１６０ｍｇ五氯硝基苯，加无菌水至１０００ｍＬ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。犃．２．２　加抗菌素黑麦番茄汁培养基８０ｇ黑麦，浸提方法同Ａ．１．２，取黑麦浸提液４５０ｍＬ，加番茄汁１５０ｍＬ，琼脂１７ｇ，碳酸钙（ＣａＣＯ３）１．２ｇ，阿莫西林１００ｍｇ，五氯硝基苯３０ｍｇ，利福平１０ｍｇ，制霉菌素１０ｍｇ，无菌水４００ｍＬ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。犃．３　液体培养基１２０ｇ冷冻豌豆，加５００ｍＬ蒸馏水高压锅煮５ｍｉｎ，过滤，滤液补足至１０００ｍＬ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。４犛犖／犜１１３５．６—２００８附　录　犅（资料性附录）病原菌形态特征图Ａ———悬于水中的菌丝体；Ｂ———孢子囊；Ｃ———有穿雄生雄器的藏卵器和卵孢子，×５００。图犅．１　病原菌形态特征图（图片引自《ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＤｕｂｌｉｎＳｏｃｉｅｔｙＮ．Ｓ．》１３：５４７５４８，１９１３）５犛犖／犜１１３５．６—２００８书书书８００２—６５３１１犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ１１３５．６—２００８中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数１０千字２００８年７月第一版　２００８年７月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１８９１３　定价８．００元