ln蛋白质的修饰与讲解

第二章蛋白质的修饰与降解第一节蛋白质的修饰蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用。磷酸化脂基化甲基化乙酰化糖基化SUMO化巴豆酰化一、磷酸化磷酸化去磷酸化催化磷酸化的蛋白激酶蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶PKAPKCPKG蛋白质酪氨酸激酶PTK非受体型Src受体型EGFRIGFRPDGFR双专一性蛋白激酶DSPKWeelERK1EKR2cAMP激活PKA影响糖代谢示意图调节基因表达调节细胞极性PKA亦可通过磷酸化作用激活离子通道，调节细胞膜电位。PKCsignaling激素目录EGFR介导的信号转导过程催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1、PP2A、PP2B、PP2C蛋白质酪氨酸磷酸酶1/3是跨膜的，类似受体2/3是游离于胞质，为非受体型二、脂基化为长脂肪链通过O或者S原子与蛋白质缀合的过程，通常是蛋白质分子的半胱氨酸残基被棕榈酰化或者法呢基化。铜蓝蛋白Leu-Ala-Gly-Cys分别催化的酶是棕榈酰基转移酶法呢基转移酶三、甲基化S-腺苷甲硫氨酸提供甲基集团甲基转移酶组蛋白LysArg四、乙酰化乙酰基乙酰基转移酶主要Lys组蛋白的乙酰化调控基因转录调控自噬调节代谢酶的活性五、类泛素化--SUMO化(smallubiquitinrelatedmodifier)小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶SUMO的C-端Gly残基和底物蛋白Lys的-氨基间形成一个异肽键SUMO的C-末端短肽切除，暴露出Gly-Gly模特序列，使其变成成熟的功能蛋白去SUMO化Ulp蛋白质SUMO化UlpUlp蛋白质SUMO化SUMO化修饰的生物学作用底物多为转录调节因子或共调节因子参与维持基因组的完整性及调节染色体的凝集与分离参与DNA修复拮抗泛素作用调节蛋白的核质转运和信号转导六、巴豆酰化巴豆酰基巴豆酰基转移酶组蛋白Lys基因活化七、不同翻译后修饰相互协调与影响细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译后修饰一种蛋白质可以有一种以上的翻译后修饰八、研究策略放射性跟踪修饰性抗体技术质谱技术第二节蛋白质的降解细胞内的蛋白质分子处于一动态平衡过程中。进行自我更新。蛋白质降解途径：泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasomesystem,UPS）自噬溶酶体（autophagy-lysosome）系统蛋白质分子降解的生理功能：1、清理不正常蛋白质的管家功能2、破坏正常蛋白质的调节功能细胞内成分的主要降解途径1、蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚泛素化(ubiquitination)的蛋白质。原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨基酸序列并将其降解。真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。2、内吞途径：将跨膜蛋白运送到溶酶体降解。3、细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-livedprotein)、蛋白聚集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。一、UPS（ubiquitin-proteasomesystem）组成20S核心颗粒蛋白酶体激活因子19S、11S、PA200分类ATP和泛素依赖的UPS-19S不依赖ATP和泛素的UPS-11S•降解变性和错误折叠的蛋白质•泛素•76个氨基酸的小分子蛋白(8.5kD)•普遍存在于真核生物而得名•一级结构高度保守蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋白质被降解的标签。1.泛素化(ubiquitination)泛素与选择性被降解蛋白质形成共价连接，并使其激活。(赖氨酸)2.蛋白酶体(proteasome)对泛素化蛋白质的降解•泛素介导的蛋白质降解过程泛素化过程E1：泛素活化酶E2：泛素携带蛋白E3：N-去稳定残基识别蛋白泛素CO-O+HS-E1ATPAMP+PPi泛素COSE1HS-E2HS-E1泛素COSE2泛素COSE1被降解蛋白质HS-E2泛素COSE2泛素CNH被降解蛋白质OE3带有成串泛素分子的底物蛋白再被26S蛋白酶复合体识别蛋白酶复合体分子量极其巨大在蛋白酶复合体腔中，蛋白质被水解TheoncoproteinSS18-SSX1promotesp53ubiquitinationanddegradationbyenhancingHDM2stability.TransfectionExampleMolCancerRes.2008Jan;6(1):127-38.稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、缬、蛋肽链内部的保守序列：PEST使蛋白质分子短命----UPS识别信号去泛素化酶（deubiquitinatingenzyme，DUB）如周期蛋白，基因表达、细胞增殖、炎症反应、诱发癌瘤（促进抑癌蛋白P53降解）蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋白酶复合体作用的结果。•体内蛋白质降解参与多种生理、病理调节作用二、自噬溶酶体系统什么是自噬？自噬（autophagy）是真核生物进化过程中高度保守一类降解途径，通过形成双层膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。自噬体的半衰期8min左右，是细胞对于环境变化的有效反应。自噬性细胞死亡,是凋亡和坏死之外的第三种程序性细胞死亡方式.细胞自噬的分类1、巨型细胞自噬(macroautophagy)，又称为大自噬，是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。2、微型细胞自噬(microautophagy)，又称为小自噬，是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞入细胞浆的自噬行为。3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperonemediatedautophagy，CMA)，是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同AutophagyAutophagyisacellulardegradationsysteminwhichcytoplasmiccomponents,includingorganelles,long-lifeproteinaresequesteredbydouble-membranestructurescalledautophagosomesandthesequesteredmaterialsaredegradedbylysosomalhydrolasesControlStarvation基础自噬：是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬过程,对细胞内物质的更新及细胞内环境稳态的维持具有不可或缺的作用。诱导自噬：是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下,细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。如哺乳动物出生后初期,由于母体不再提供营养来源,幼体的细胞自噬非常活跃,这为维持其生命活动起了非常重要的作用。基础自噬和诱导自噬自噬进程1、自噬的诱导激活2、自噬体的成核和延伸3、自噬体与溶酶体融合4、内容物降解第一步：自噬的诱导一系列自噬相关基因（autophagy-relatedgene，Atg）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是Atg1/ULK1复合体，包括Atg1、Atg13、Atg17,mTORC1磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。mTORC1失活自噬激活ULK1去磷酸化Atg7-Atg3-induction第二步：自噬体的成核，细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样结构:分离膜(isolationmembrane，IM)，然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(pre-autophagosomePAS)，是自噬发生的标志之一。需要Atg6（Beclin1）-ClassⅢPI3K复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L复合体.形态特点：自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内腔变得不明显。多种ATG蛋白参与自噬前体的组装。组分来源：来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质网或高尔基复合体等膜结构。Atg7-Atg3-induction第二步：自噬体膜的延伸，自噬前体在两个类泛素系统作用下，包括Atg12-Atg5-Atg16L复合体和LC3(Atg8)作用下，LC3不断接受PE，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡。形态特点：自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。Atg7-Atg3-第三步：自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。形态特点：多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。第四步：自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，成为降解性自噬体(degradativeautophagicvacuole)。①自噬的诱导②自噬体的成核和延伸③自噬溶酶体的形成④内容物的降解自噬的调节1、mTOR活性调节2、胰岛素（激活mtor；抑制FoxO3）自噬调控的中心分子TOR(targetofrapamycin)雷帕霉素作用的靶位点(Tagetofrapamycin,TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器,它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。TOR(targetofrapamycin)能感受细胞的多种变化信号,加强或降低自噬的发生水平。细胞内ATP水平、缺氧等细胞信号都可直接或间接通过TOR将其整合,从而改变细胞的自噬发生,应对不同的外界环境刺激。Atg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,哺乳动物中同源蛋白ULK1,ULK1以复合物的形式存在,除了ULK1本身,还包括mAtg13、FIP200(一种与黏着斑激酶FAK相互作用的蛋白)和Atg101。Atg1/ULK1蛋白激酶复合体当营养足够时,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)与Atg1/ULK1复合物与结合,通过磷酸化Atg1/ULK1和ATG13从而抑制自噬的起始从而抑制自噬。在饥饿的条件下,mTORC1从Atg1/ULK1复合物上分离,从而诱导自噬体的成核(Nucleation)和延伸(Elongation)。AMPK是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。低ATP水平状态下(如饥饿或缺氧)AMPK能感受AMP的水平变化而激活,从而磷酸化结节性硬化复合体TSC2(tuberoussclerosisprotein)加强TSC1/2对Rheb的抑制,最终使mTOR的活性被抑制,诱导细胞发生自噬。AMPK(AMP-activatedproteinkinase)Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的Atg基因,能通过影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。营养物质缺乏时,Atg9与Atg23、Atg27结合,将它们运输至PAS;Atg9/mAtg9在Atg5-Atg12-Atg16连接系统中,首先由Atg7(E1)活化Atg12;然后将Atg12传递给类Atg10（E2）最后,Atg12被传递到Atg5,与Atg5的Lys共价结合形成Atg12-Atg5复合物。自噬发生时,Atg16和Atg12-Atg5结合，Atg16含有一个螺旋卷曲结构易于形成低聚物,使得其能把更多的Atg12-Atg5连接起来形成巨大复合物。从而可能为参与自噬泡形成的蛋白质提供相互作用的平台。自噬发生时,此复合物定位于隔离膜上,参与LC3-II的形成过程,从而促进自噬泡膜的延长。自噬发生过程中有两组类泛素化修饰过程,分别发生在Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统中,用于隔离膜的延长和自噬泡的形成。Atg