DBS32 004-2014 食品安全地方标准 青奥会食品中致病菌快速检测

DBS江苏省地方标准DBS32/004—2014食品安全地方标准青奥会食品中致病菌快速检测2014-06-30发布2014-06-30实施江苏省卫生和计划生育委员会发布DBS32/004—2014I前言本标准系首次发布。DBS32/004—20141青奥会食品中致病菌快速检测1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌的病原菌自动检测系统检测方法和实时荧光PCR检测方法，以及志贺氏菌实时荧光PCR检测方法。本标准适用于2014年青奥会食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌的快速检测。其他大型活动可参考本标准执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。第一法病原菌自动检测系统检测3原理病原菌自动检测系统利用多聚酶链反应（PCR）扩增目标细菌DNA特异片段，筛选目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和单核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的试剂片，装入PCR反应管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。PCR试剂片含有荧光染料，能结合双链DNA，受光激发后能发出荧光信号。在检测过程中，病原菌自动检测系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，判定阳性或阴性结果。4设备和材料4.1病原菌自动检测系统。4.2恒温空气振荡摇床：36℃±1℃、30℃±1℃。4.3加热槽：37℃±1℃、95℃±1℃。4.4冷却槽。4.5天平：感量0.1g。4.6均质器。4.7冰箱：4℃、-20℃。4.8微量移液器：1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL。DBS32/004—201424.9灭菌吸头：10μL、200μL、1000μL。4.10PCR反应管及支架。4.11pH计或pH试纸。5试剂与培养基5.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格，121℃高压灭菌30min。5.2病原菌自动检测系统检测试剂盒（溶菌试剂、试剂片）。5.3培养基5.3.17.5%氯化钠肉汤：见GB4789.10-2010附录A中A.2。5.3.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见GB4789.4-2010附录A中A.1。5.3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB4789.4-2010附录A中A.3。5.3.4李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB4789.30-2010附录A中A.3。5.3.5改良EC肉汤：见GB/T4789.36-2008附录A中A.1。5.3.63％氯化钠碱性蛋白胨水：见GB4789.7-2013附录A中A.1。6操作步骤6.1样品制备和增菌培养6.1.1金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌的样品处理与增菌液按照GB4789.10-2010中第一法5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200rpm/min振摇4h。6.1.2沙门氏菌沙门氏菌的样品处理与增菌液按照GB4789.4-2010中5.1前增菌和5.2进行，BPW增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200rpm/min振摇2h；移取0.1mL，转接种于SC增菌液，36℃±1℃，200rpm/min振摇4h。6.1.3单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌的样品处理与增菌液按照GB4789.30-2010中5.1进行，LB1增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，30℃±1℃、200rpm/min振摇2h；移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，30℃±1℃，200rpm/min振摇4h。6.1.4大肠埃希氏菌O157：H7大肠埃希氏菌O157：H7的样品处理与增菌液按照GB/T4789.36-2008中第一法5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200rpm/min振摇4h。DBS32/004—201436.1.5副溶血性弧菌副溶血性弧菌的样品处理与增菌液按照GB4789.7-2013中5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200rpm/min振摇4h。6.1.6所有剩余增菌液均存于2℃～8℃，以备对阳性检测结果的确认。6.2上机操作6.2.1打开加热槽分别至37℃和95℃。检查预冷的冷却槽（4℃）。开机并启动病原菌自动检测系统软件。如果仪器自检后显示“校正”，按屏幕提示进行校正操作。6.2.2溶菌操作将标记好的溶菌管放至管架上，在每支溶菌管加入200μL溶菌试剂。将每个增菌后的5μL样品加入相应的溶菌管中，盖上盖子。把管架放在37℃加热槽中20min。再将管架放在95℃的加热槽中10min。最后将管架放在冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30min内使用完毕），样品冷却5min。6.2.3溶菌产物转移将PCR反应管支架放到专用冷却槽上，然后将含有试剂片的PCR反应管放入到支架内。用加样器将50μL溶菌产物加入管中，密封PCR反应管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转入PCR反应管中。6.2.4扩增和检测在系统中输入标本号并在“Target”项目下选择相应的致病菌，然后点击“Apply”确定，再点击升温图标，开始预热仪器。待预热结束后，将加入溶菌产物的PCR反应管放入仪器中。运行软件至反应结束。6.3实验结果与报告实验结束后系统会自动得出实验结果，结果报告：绿色“-”表示阴性结果；红色“+”表示阳性结果；黄色“？”表示不确定结果；黄色“？”带斜线表示错误结果。错误结果需进行重复实验至错误取消。如结果为阴性，则可按阴性结果出具报告；如结果是阳性或不确定，需按照相应国家标准进行检验（使用6.1.6中保存的增菌液进行检测，不需要重新取样），根据国家标准方法得出的结果出具报告。第二法实时荧光PCR法7设备和材料7.1实时荧光PCR仪。7.2冷冻离心机。7.3均质器。7.4恒温空气振荡摇床：36℃±1℃、30℃±1℃、41.5℃±1℃。7.5恒温水浴锅：95℃±1℃。7.6天平：感量0.1g。DBS32/004—201447.7冰箱：4℃、-20℃。7.8微量移液器：1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL。7.9灭菌吸头：10μL、200μL、1000μL。7.10厌氧罐。7.11灭菌1.5mL离心管。8试剂与培养基8.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格，121℃高压灭菌30min。8.2TaqDNA聚合酶：5U/μL。8.3dNTP：10μmol/L。8.4DNA提取试剂：称取0.1gChelex100粉末，加水定容至100mL，保存于-20℃备用；或使用商品化的DNA提取试剂盒。8.510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。8.6引物和探针：引物和探针序列见附录A。加水稀释至10mmol/L，其中探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。8.7培养基8.7.17.5%氯化钠肉汤：见GB4789.10-2010附录A中A.2。8.7.2缓冲蛋白胨水（BPW）：见GB4789.4-2010附录A中A.1。8.7.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB4789.4-2010附录A中A.3。8.7.4李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB4789.30-2010附录A中A.3。8.7.5改良EC肉汤：见GB/T4789.36-2008附录A中A.1。8.7.63％氯化钠碱性蛋白胨水：见GB4789.7-2013附录A中A.1。8.7.7志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB4789.5-2012附录A中A.1。9操作步骤9.1样品制备和增菌培养9.1.1金黄色葡萄球菌操作步骤同6.1.1。9.1.2沙门氏菌操作步骤同6.1.2。DBS32/004—201459.1.3单核细胞增生李斯特氏菌操作步骤同6.1.3。9.1.4大肠埃希氏菌O157：H7操作步骤同6.1.4。9.1.5副溶血性弧菌操作步骤同6.1.5。9.1.6志贺氏菌志贺氏菌的样品处理与增菌液按照GB4789.5-2012中5.1进行，增菌液置于厌氧罐，并放置于恒温空气振荡摇床中，41.5℃±1℃、200rpm/min振摇4h。9.1.7增菌液密封后放置于4℃冰箱保存。9.2致病菌DNA提取取9.1中培养的增菌液1mL，加入1.5mL无菌离心管中，8000rpm/min离心5min，吸弃上清；加入50μLDNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，12000rpm/min，4℃离心5min，取上清保存于-20℃备用。注：也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。9.3实时荧光PCR检测9.3.1配置PCR反应体系（25μL）：10×PCR缓冲液2.5μL，引物各0.5μL，探针1μL，dNTP1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，水17μL，模板DNA2μL。9.3.2反应条件：95℃预变性30s；94℃变性5s，60ºC退火延伸40s，进行40个循环。PCR反应参数可根据PCR仪型号的不同进行适当的调整。9.3.3检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性菌株DNA，阴性对照为用水代替样品进行增菌得到的DNA提取液，空白对照为水。9.4实验结果与判定阳性对照应出现典型扩增曲线，Ct值30；同时，阴性对照和空白对照应无扩增曲线，Ct值≥40。否则，实验视为无效，需重新实验。实验结果Ct值≥40，可判定样品结果为阴性，直接报告目标致病菌未检出；Ct值≤35，样品结果为阳性；Ct值35而40，为可疑结果。阳性结果与可疑结果须按照相应GB4789标准进行检验（使用9.1.7中保存的增菌液进行检测，不需要重新取样），根据国家标准方法得出的结果判定。DBS32/004—20146AA附录A（规范性附录）致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列A.1致病菌实时荧光PCR法中所用的引物探针序列见表A.1。表A.1致病菌实时PCR检测所用引物和探针序列致病菌名称引物序列探针序列副溶血性弧菌5’-GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGT-3’5’-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3’5’-CATTCGCGTGGCAAACATC-3’金黄色葡萄球菌5’-AAATTACATAAAGAACCTGCGACA-3’5’-AATTTAACCGTATCACCATCAATCGCTTT-3’5’-GAATGTCATTGGTTGACCTTTGTA-3’单核细胞增生李斯特氏菌5’-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3’5’-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3’5’-CGCGACCGAAGCCAACTA-3’沙门氏菌5’-CCAGTTTATCGTTATTACCAAAGG-3’5’-CTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACA-3’5’-ATCGCACCGTCAAAGGTC-3’大肠埃希氏菌O157：H75’-TTTCATACTTATTGGATGGTCTCAA-3’5’-AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTAAGG-3’5’-CGATGAGTTTATCTGCAAGGTGAT-3’志贺氏菌5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’5’-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3’5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’_________________________________