碳水化合物测定

第四章碳水化合物的测定第一节碳水化合物的概述碳水化合物是生物界三大物质之一，是自然界最丰富的有机物质。碳水化合物主要存在于植物界，如谷类食物和水果蔬菜的主要成分是CH2O。一、碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物，但此定义有局限性，碳水化合物不都是糖类，糖类也不都是碳水化合物。碳水化合物存在形式呈多样化，除单糖、多糖等存在形式，糖还与蛋白质结合为糖蛋白和蛋白多糖，还可与脂肪结合为糖脂。二、碳水化合物的分类按照糖单位数目可分成单糖、双糖、寡糖、多糖；也可按能否被人体消化吸收分为有效化合物（单糖、寡糖、淀粉）和无效碳水化合物（纤维、果胶）。三、测定方法物理法（相对密度法、折光法、旋光法）、化学法（还原糖法、碘量法、比色法）、色谱法（纸色谱、薄层色谱、HPLC、GC）、酶法（乳糖、半乳糖、淀粉）、重量法（纤维素、果胶）。第二节可溶性糖类的测定一、可溶性糖类的提取与澄清：食品中可溶性糖类通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖、双糖及低聚糖等。一般须将样品磨碎、浸渍成溶液（提取液），并对提取液进行纯化，经过滤、除杂后再测定。（一）提取1、常用提取剂有水及乙醇（当样品中含大量淀粉、蛋白质时，或者细胞壁厚的情况下，醇的穿透和溶解能力强于水）。常结合脱脂预处理，样品不同，工艺各异。如：木耳多糖采用脱脂后，热水浸提的方式提取，去除蛋白质后测定多糖含量；或采用醇提方式，避免蛋白质干扰。提取应遵循的原则：①取样量和稀释倍数的确定，要考虑所采用的分析方法的检测范围。一般提取后，每mL含糖量应在0.5-3.5mg之间。提取10g含糖2%的样品可在100mL容量瓶中进行；而对于含糖较高的食品，可取5-10g样品于250mL容量瓶中进行提取。②含脂肪的食品，如乳酪,巧克力,蛋黄酱及蛋白杏仁糖等，通常需经脱脂后再以水进行提取。一般以石油醚处理一次或几次，必要时可以加热。每次处理后，倾去石油醚层（如分层不好，可以进行离心分离），然后用水提取。③含大量淀粉和糊精的食品，如粮谷制品，某些蔬菜，调味品，用水提取会使部分淀粉，糊精溶出，影响测定，同时过滤也困难，为此，宜采用乙醇溶液提取。乙醇溶液的浓度应高到足以使淀粉和糊精沉淀，通常用70－75%的乙醇溶液。若样品含水量较高，混合后的最终浓度应控制在上述范围内。提取时可加热回流，然后冷却并离心，倾出上清液，如此提取2－3次，合并提取液，蒸发除去乙醇。用乙醇溶液作提取剂时，提取液不用除蛋白质，因为蛋白质不会溶解出来。④含酒精和二氧化碳的液体样品，通常蒸发至原体积1/3－1/4，以除去酒精和二氧化碳。但酸性食品，在加热前应预先用氢氧化钠调节样品溶液至中性，以防止低聚糖被部分水解。⑤提取固体样品时，为提高提取效果，有时需加热，加热温度一般控制在40~50℃，一般不超过80℃，温度过高时可溶性多糖溶出，增加下步澄清工作的负担。（二）澄清为沉淀一些干扰物质，使提取液清亮透明，达到准确的测量糖类，常用澄清剂来澄清，澄清剂不仅要能除去干扰物质，保留住糖分，并且要容易去除。常见的澄清剂的种类有以下几种：中性醋酸铅：可除蛋白、果胶等，不还原糖，适宜果蔬、焙烤、糖浆样品。乙酸锌和亚铁氰化钾溶液：用于富含蛋白质的提取液，常用于沉淀蛋白质，对乳制品最理想。主要是生成的亚铁氰酸锌（白色沉淀）与蛋白质共同沉淀。所以使动物性样品的沉淀剂。硫酸铜和氢氧化钠溶液：富含蛋白质的糖样品，如乳品碱性醋酸铅：除蛋白质、有机酸、单宁等，对果糖影响大。氢氧化铝溶液：可除胶体、用于浅色糖净化。活性炭：可除色素，吸附蔗糖，造成损失6%~8%。二、还原糖的测定：还原糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等分子中含有游离醛基或酮基的单糖单和含有游离醛基的二糖都具有还原性。蔗糖和多糖是非还原糖。糖分的还原性的测定方法叫还原糖法。1.碱性铜盐法之直接滴定法（要求重点掌握）（1）原理：如示意图所示，该法是将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；这种沉淀很快与酒石酸钾反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀；这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；二价铜全部被还原后，稍过量还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点；根据样液消耗量可计算出还原糖含量。（2）试剂：①碱性酒石酸铜甲液：15g硫酸铜+0.05g次甲基蓝定容至1000mL②碱性酒石酸铜乙液：50g酒石酸钾钠+75gNaOH+4g亚铁氰化钾定容至1000mL（胶塞玻璃瓶）③乙酸锌溶液：澄清剂④亚铁氰化钾溶液：澄清剂⑤葡萄糖标准溶液：准确称取经98~100℃干燥至恒重的无水葡萄糖1.000g，加水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL盐酸（防止微生物生长）。（3）操作：A样品处理：取适量样品，按前面的讲过原则对样品提取，提取液移入250mL容量瓶，慢慢加入5mL乙酸锌溶液和5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30min。用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。（目的？）B、碱性酒石酸铜溶液的标定：准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准液的总体积。平行操作3次，取平均值。F=c×VF——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量,mg;c——葡萄糖标准溶液的浓度,mg／mL；V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。C、样品溶液预测：吸取碱性洒石酸铜甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加水10mL，加玻璃珠3粒，加热使其在2min内至沸，准确沸腾30秒钟，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色变浅时．以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。D、样品溶液测定：吸取碱性洒石酸铜甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。（4）结果计算F——10mL碱性酒石酸铜相当于葡萄糖量，mg；m——样品质量，g；V——测定时平均消耗的样品液体积，mL;250——样品溶液的总体积，mL计算还原糖的量有两种方法：A、用已知浓度的葡萄糖标准溶液标定的方法求F。B、利用通过实验编制出的还原糖检索表来计算。（5）适用范围及特点：本法又称快速法，它是在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。本法是国家标准分析方法。（6）说明：①在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2+，得到错误的结果。②碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。③滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型；三是氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。④次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与Cu2+反应，Cu2+完全反应后，稍过量的还原糖才与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色，指示到达终点。⑤样品溶液预测的目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1%左右)，测定时样品溶液消耗体积与标定葡萄糖标准溶液时消耗体积相近，通过预测可了解样液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使其消耗样液量在10mL左右；二是通过预测可知样液大概消耗量，以便正式测定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留下1mL左右样液在续滴定时加入，以保证在1min内完成续滴定工作，提高测定准确度。⑥影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。反应液的碱度直接影响Cu2+与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。在一定范围内，溶液碱度愈高，Cu2+的还原愈快。因此，必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热源一般采用800w电炉，电炉温度恒定后才能加热，热源强度应控制在使反应液在2min内沸腾，且应保持一致。否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大,一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少；滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述实验条件，应力求一致。平行试验样液消耗量相差不应超过0.1mL。⑦为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，使之与Cu2O生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀。2.碱性铜盐法之高锰酸钾滴定法：（1）原理将一定量的样液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜，经过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量，再从检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖含量。（2）适用范围及特点：本法是国家标准分析方法，适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。方法的准确度高，重现性好，准确度和重现性都优于直接滴定法。但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。（3）试剂①碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g硫酸铜(CuSO4。5H2O)加适量的水溶解，加入0.5mL硫酸加水稀释至500mL，用精制石棉过滤。②碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠和50g氢氧化钠，加适量的水溶解并稀释到500ml，用精制石棉过滤，贮存在橡皮塞玻璃瓶中。③精制石棉：取石棉，先用3mol/L盐酸浸泡2~3小时，用水洗净，再用10%氢氧化钠浸泡2～3小时，倾去溶液，再用碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净，再以3mol/L盐酸浸泡数小时，用水洗至不呈酸性。加水振荡，使之成为微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存在玻璃瓶中，即可用于填充古氏坩锅过滤用。④0.02mol/L高锰酸钾标准溶液：称取3.3g高锰酸钾溶于1050mL水中，缓缓煮沸20~30min，冷却后于暗处密闭保存数日，用垂融漏斗过滤，保存于棕色瓶中。注：标准液应以基准草酸钠标定其浓度。（4）测定方法①样品处理：取适量样品，根据样品的组成、性状进行提取，提取液移入250mL容量瓶中，慢慢加入10mL碱性酒石酸铜甲液和4mL1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀，静置30分钟。用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液供测定用。②测定吸取50mL处理后的样品溶液于400mL烧杯中，加碱性酒石酸铜甲、乙液各25mL，盖上表面皿，置电炉加热，使其4min内沸腾，准确沸腾2min，趁热用铺好石棉的古氏坩埚\垂融坩埚或漏斗抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止。将坩埚放回原400mL烧杯中，加25mL硫酸铁溶液及25mL水，玻璃棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以高锰酸钾标准溶液滴定至微红色为终点。记录高锰酸钾标准溶液消耗量。同时吸取50mL水代替样液，按上法做试剂空白试验。记录空白试验消耗高锰酸钾溶液的量。（5）计算中：c——高锰酸钾标准溶液的浓度，mol/L;V——测定用样液消耗高锰酸钾标准溶液体积，ml;V0——试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液