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几种蛋白质含量测定方法的比较张小涛制作生物化学实验之几种蛋白质含量测定方法生物化学实验之（一）凯氏定氮法（二）双缩脲法（三）紫外吸收法（四）Folin—酚试剂法Page2ID:坚强De小男孩3Page3ID:坚强De小男孩（一）凯氏定氮法凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4反应式式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3原理凯氏定氮法Page4ID:坚强De小男孩（一）凯氏定氮法凯氏定氮法特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置,可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。Page5ID:坚强De小男孩（二）双缩脲法(Biuret)双缩脲法原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出1个分子氨后得到的产物。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。Page6ID:坚强De小男孩（二）双缩脲法(Biuret)凯氏定氮法特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响,采用0.5g样品,40mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20mg蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。Page7ID:坚强De小男孩（三）紫外吸收法紫外吸收法原理蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。Page8ID:坚强De小男孩（三）紫外吸收法紫外吸收法特点优点是简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。Page9ID:坚强De小男孩（四）Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法原理Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Page10ID:坚强De小男孩（四）Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法特点Folin—酚试剂法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。谢谢收看[e-mail]18363828281张小涛