银染操作步骤(精)

银染操作步骤1.固定:电泳结束后,取凝胶放入约100ml固定液中,在摇床上室温摇动20分钟,摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。固定液的配制:依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40mlMilliQ级纯水或双蒸水,混匀后即成100ml固定液,可大量配制室温存放。2.30%乙醇洗涤:弃固定液,加入100ml30%乙醇,在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。30%乙醇的配制:70mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇,混匀后即成100ml30%乙醇。3.水洗涤:(洗2次弃30%乙醇,加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。4.增敏:(辅染现配现用弃水,加入100ml银染增敏液(1X,在摇床上室温摇动2分钟,摇动速度为60-70rpm。银染增敏液(1X的配制:99mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X,混匀后即为银染增敏液(1X。银染增敏液(1X配制后需在2小时内使用。银染增敏液(100X的配制:即2.8%硫代硫酸钠溶液,需用黑袋包裹避光保存。5.水洗涤(共2次:弃原有溶液,加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1分钟,摇动速度为60-70rpm。弃水,再加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1分钟,摇动速度为60-70rpm。6.银染:弃水,加入100ml银溶液(1X,在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。银溶液(1X的配制:99mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X,混匀后即为银溶液(1X。银溶液(1X配制后需在2小时内使用,最好是现配现用。银溶液(100X的配制:称取5g硝酸银,加水溶解并稀释至500ml,摇匀即得1%的硝酸银溶液,需用黑袋包裹避光保存。7.水洗涤:弃原有溶液,加入100mlMilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1-1.5分钟,摇动速度为60-70rpm。注意:水洗涤的时间不能超过1.5分钟。8.显色:弃水,加入100ml银染显色液,在摇床上室温摇动3-10分钟,直至出现比较理想的预期蛋白条带,摇动速度为60-70rpm。银染显色液的配制:90mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入10ml银染基本显色液(10X,再加入0.05ml银染显色加速液(2000X,混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20分钟内使用。银染基本显色液(5X的配制:称取碳酸钠60g,加水溶解并稀释至500ml,摇匀即得12%碳酸钠溶液。9.终止:加适量EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠终止弃银染显色液,加入100ml银染终止液(1X,在摇床上室温摇动10分钟,终止时有气体产生属正常现象,产生的气体为二氧化碳。银染终止液(1X的配制:95mlMilliQ级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20X,混匀后即为银染终止液(1X。银染终止液(1X配制后宜当天使用。10.水洗涤:弃银染终止液,加入100mlMilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动2-5分钟,摇动速度为60-70rpm。11.保存:可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。常见问题:1.背景太深:a.显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束,显色反应时间过长会导致背景很深。b.洗涤不充分。洗涤时间过短,或洗涤液加入的量不足,或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合,或摇动速度过慢,导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间,摇床的推荐速度为60-70rpm。c.凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量,另一方面对于不是最常用的Bis-Tris缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分,以降低背景。d.水的纯度太低。需使用大于16MΩ·cm的高纯度水。2.蛋白条带非常浅:a.蛋白的半胱氨酸(Cysteine残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于银染非常重要,半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。b.银染后水洗涤时间过长。在银溶液染色时需严格控制水洗涤的时间,水洗涤的时间不能超过1.5分钟,否则会导致过多的银离子被洗去,导致检测灵敏度下降。c.上样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3ng,对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被检测到。d.固定步骤后的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留,影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间,可以适当延长洗涤时间。3.凝胶上出现小点或或其它非蛋白的痕迹:a.凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器,并加入足量的各种溶液,同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。b.用于银染的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤,随后用自来水充分冲洗,最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于银染,并注意避免各种可能的蛋白污染。为确保充分洗涤干净,对于耐硝酸的容器,例如玻璃容器,可以在上述洗涤剂及自来水洗涤后用50%硝酸洗涤,随后用高纯度水充分洗涤。c.指纹或其它压痕。请注意戴手套操作,切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。d.有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。4.在60-70kD处出现一片模糊的蛋白染色背景:皮肤上脱落的角蛋白(keratin污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作,另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开,甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。5.在凝胶的顶端处出现黄色背景:a.样品中DTT浓度很高。采用其它适当的还原试剂,或者在许可范围内适当减少DTT的用量。b.采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。换用Tris-Tricine-SDS电泳体系则可显著消除此黄色背景。6.银在染色器皿中出现沉淀:染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次银染时的残余试剂。需确保把染色器皿洗涤干净。