DB34T 1361-2011 饲料中氯霉素的测定-气相色谱质谱法

ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1361—2011饲料中氯霉素的测定－气相色谱质谱法Determinationofchloramphenicolinfeed－Gaschromatographymassspectrometrymethod2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1361—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：刘红云、蔡一杰、吴蕾、明文庆、张莉、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。DB34/T1361—20111饲料中氯霉素的测定－气相色谱质谱法1范围本标准规定了饲料中氯霉素检验的气相色谱质谱测定方法。本标准适用于饲料中氯霉素的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约200g，粉碎至过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。4原理饲料经磷酸缓冲液均质后，用乙酸乙酯提取。用硅胶和C18固相萃取柱对乙酸乙酯提取物进行净化和富集。用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）衍生化，供气相色谱质谱进行定性和定量分析。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水的规定。5.2氯霉素标准品：纯度≥99％。5.3标准储备液：准确称取氯霉素标准品适量，用甲醇溶解配制成100µg/mL，作为标准储备溶液。4℃冰箱保存，有效期1个月。5.4标准工作液：精密量取适量氯霉素储备液，用甲醇稀释成浓度为0.5、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的标准工作液。4℃保存7天。5.5衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷TMCS（99:1）。5.6pH6.8磷酸缓冲液：取0.2mol/L磷酸氢二钾溶液250mL，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，加水使溶解成1000mL，摇匀，即得。5.7甲醇：色谱纯。5.8乙腈：色谱纯。5.9乙酸乙酯：色谱纯。DB34/T1361—201125.10二氯甲烷。5.11正己烷。5.12气相色谱质谱淋洗液：二氯甲烷／正己烷=（1：1）。5.13固相萃取柱：规格500mg/6mL，填料C18。5.14硅胶固相萃取柱：规格1000mg/6mL。5.15微孔滤膜：孔径0.25µm，有机相。6仪器设备6.1气相色谱质谱仪。6.2高速冷冻离心机，不低于10000r／min。6.3饲料粉碎机。6.4氮吹仪。6.5旋转蒸发仪。6.6固相萃取装置。6.7分析天平，感量0.0001g，0.001g。6.8振荡器。6.9涡旋混合器。6.10超声波清洗机。6.11离心管，50mL。6.12梨形瓶，50mL。6.13单通道可调移液器：1～10µL、5～50µL、50～200µL、200～1000µL。7测定步骤7.1试样提取称取粉碎后的饲料样品5g（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入l0mLpH6.8磷酸缓冲液，混合均匀。用30mL乙酸乙酯分3次提取，振荡30min，10000r／min离心5min，合并提取液，在55℃水浴下旋蒸掉大部分溶剂，剩余的溶剂用氮气吹至近干，用5mL5％乙腈水溶液溶解残留物。7.2净化硅胶固相萃取小柱依次用5mL乙腈、5mL淋洗液活化；（7.1）项下的提取液残留物上样；5mL气相色谱质谱淋洗液淋洗，5mL20％乙腈水溶液洗脱。用6mL乙酸乙酯分三次提取洗脱液，合并提取液并吹干，用5mL5％乙腈水溶液溶解残留物，待C18固相萃取柱进一步净化。C18小柱依次用5mL乙腈、5mL水活化，上样，5mL水淋洗，5mL乙腈洗脱，收集洗脱液备用。7.3样品衍生化用氮气吹干上述乙腈洗脱净化液，加入100µL衍生试剂，密封后70℃衍生1h，氮气吹干，加0.5mL正己烷溶解。同时分别取标准工作系列（5.3）1mL用氮气吹干后，加入100µL衍生试剂，按试样同法操作。待气相色谱质谱分析。7.4气相条件DB34/T1361—20113色谱柱：5％苯基甲基聚硅氧烷，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm或性能相当的色谱柱。进样口温度：250℃。升温程序：起始温度100℃（保持1min），以30℃/min的速率升温至280℃（保持9min）。载气：氦气纯度99.999％。流量：0.8mL／min。进样方式：不分流进样。进样体积：1.0μL。7.5质谱条件样品离子源：负化学电离源（反应气为甲烷）。甲烷：纯度99.999％。离子源温度：150℃。传输线温度：250℃。检测电压：500V。选择离子收集模式：收集质荷比为73，147，221，281，355，429m/z的6个碎片离子。7.6上机测定取标准工作液和样品试液分别注入气相色谱质谱仪记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8定性定量方法定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于0.5％。特征离子基峰丰度与标准品相差不大于20％。定量方法：以73，147，221，281，355，429峰面积之和进行校正定量。9结果计算按照下式计算试样中药物残留的含量：ACsVXAsm××=×.....................................(1)式中：X——中药物的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；A——样溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；As——准溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；V——容体积，单位为毫升（mL）；Cs——准溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；m——样质量，单位为克（g）。计算结果扣除空白值，平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。10检测方法灵敏度、准确度、精密度10.1灵敏度DB34/T1361—20114本方法的检测限为0.1µg/kg。10.2准确度本方法添加浓度1.0µg/kg，回收率为80％～120％。10.3精密度本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤15％。DB34/T1361—20115AA附录A（资料性附录）氯霉素标准品衍生物的选择离子质谱图图A.1氯霉素标准品衍生物的选择性离子质谱图_________________________________