db34 t 196-1999 杂交水稻及其亲本种子检验规程真实性和品种纯度的基因指纹鉴定法

安徽省地方标准杂交水稻及其亲本种子检验规程真实性和品种纯度的基因指纹鉴定法RulesforhybridanditsparentsinricetestingMolecularidentificationofgenuinenessandpurityDB34/T196-19991范围本标准规定了用基因指纹鉴定种子真实性和品种纯度方法中的定义、原理、仪器、试剂和溶液、程序、结果计算以及结果报告。本标准适用于杂交水稻及其亲本种子真实性和品种纯度的检测。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨、使用下列标准最新版本的可能性。GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定3定义本标准采用下列定义。水稻基因指纹某一品种DNA结构和组成的特征。4原理品种的不同是由于其遗传物质DNA组成和结构不同而致，因此，可以利用RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）分子标记技术，对不同杂交水稻组合及其亲本进行PCR（PolymeraseChainReaction）扩增反应，从中筛选出能够区别不同杂交水稻组合及其亲本的多态性DNA片段。在比较分析的基础上，将那些具有基因型特异性的DNA片段进行克隆、测序，借助计算机软件设计并合成特异性标志引物。利用这些标志引物，同受检材料进行稳定的特异性序列扩增，根据有无标记带的出现，从而达到快速、准确地鉴定杂交水稻组合及其亲本的目的。5仪器a)PCR扩增仪。b)高速冷冻离心机，转速为10000rpm以上。c)电泳仪，满足稳压500v以上。d)紫外光透射仪。e)微量进样器和与之配套的吸头，规格为20μl、100μl、1ml。f)重蒸水蒸馏器。g)冰箱，低温（-20℃以下）和普通型。h)照像机，带紫外光滤光片。i)高压灭菌锅。j)量筒，规格为50ml、100ml、500ml。安徽省技术监督局1999-12-30发布2000-01-01实施DB34/T091-1993k)薄壁PCR扩增管，规格为0.2ml。l)Eppendorf离心管，规格为1.5ml。m)天平，感量为0.1g。6试剂和溶液6.1试剂试剂等级要求为化学纯或化学纯以上。a)三羟甲基氨基甲烷（Tris）b)乙二胺四乙酸钠（EDTA）c)氯化钠（Nacl）d)十二烷基磺酸钠（SDS）e)异丙醇f)乙醇g)4种脱氧核苷酸（dNTP）h)TaqDNA聚合酶i)标准分子量标记j)特异性引物k)琼脂糖l)溴化乙锭m)溴酚蓝n)蔗糖o)乙酸p)重蒸馏水6.2溶液a)DNA提取液100mmol/LTris—HCL，20mmol/LEDTA（pH8.0），500mmol/LNacl，1.5%SDS，高压灭菌后，在（4±2）℃的环境下保存。b)凝胶缓冲液和电泳缓冲液40mmol/LTris—HCL，1mmol/LEDTA（pH8.0），高压灭菌后在（4±2）℃的环境下保存。c)6倍的凝胶加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，在（4±2）℃的环境下保存。d)溴化乙锭荧光染色液称取1.0g溴化乙锭溶于100ml水中，磁力搅拌至完全溶解，然后转移至棕色瓶中，在（4±2）℃的环境下保存。e)10倍反应缓冲液500mmol/LKCL，100mmol/LTris—HCL（pH8.0），25mmol/LMgcl2，0.1%（W/V）明胶。7程序7.1取样DB34/T091-1993检验样品的扦样，分样和保存，按GB/T3543.2的规定执行。检验样品的重量为500g，试验样品的数量为400粒，若仅作真实性鉴定则检验数量为50粒。7.2样品DNA提取a)取单粒受检种子粉碎至粉末状，装入1.5ml的离心管中。b)加600μlDNA提取液，50℃条件下水浴1h，在此期间，振荡2次-3次。c)在10000rpm、4℃的条件下离心10min，将上清液转移至另一只1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置片刻。d)离心10min（条件同上），弃上清液，将沉淀物用200μl的70%乙醇洗涤，再离心10min（条件同上），重复洗涤两次。e)将沉淀物置常温下30-60分钟后，溶于20μl重蒸馏水中。7.3PCR扩增反应7.3.1扩增反应方法用PCR特异性引物（根据鉴别的杂交水稻组合及其亲本的不同而选择适宜的引物，引物选择见（附录A）同受检种子的基因组DNA进行PCR扩增反应。7.3.2扩增反应条件每35μl反应体积中包括0.1mmol/L的dNTP混合物，正向和反向引物各0.2mmol/L，2μlTaqDNA聚合酶和2μl提取物（含50ng左右的水稻基因组DNA），加3.5μl10倍反应缓冲液，最终用重蒸馏水定容至35μl，在PCR扩增仪上进行扩增。7.3.3扩增反应程序94℃5min变性后，按94℃1min、55℃1min、72℃2min的设置进行35个循环，循环结束后在72℃下延伸5min。7.4琼脂糖凝胶制备称取1.2g琼脂糖，加100ml凝胶缓冲液，加热完全熔化琼脂糖待冷却到50℃-60℃后，加入1μl溴化乙锭摇匀后倒入两端用胶带封好的凝胶板中，插入样品梳。7.5进样待琼脂糖凝胶完全凝固后，小心拔出样品梳，将凝胶连同胶板一起放入电泳槽中，注入一定的电泳缓冲液使基没过凝胶，用微量进样器吸取2μl-10μl样品和1μl-2μl6倍的加样缓冲液混匀后，再加入到样品孔中。7.6电泳在靠近加样孔一端的电极接上负极，另一端接上正极。一打开电源，稳压在90V，电泳0.5h-1.5h左右，具体时间可按溴酚蓝迁移距凝胶边缘1cm-2cm来定。7.7鉴定关闭电源，将凝胶连同胶板小心地取出，在紫外光下观察电泳条带，并拍照记录。在紫外光下观察，若出现特征性的条带即表明鉴定的材料是同标准样品一样的品种；若无特征性条带，即表明受检材料是与标准样品不同的品种，从而达到鉴定种子真实性以及测定品种纯度的目的。8结果计算DB34/T091-1993纯度检验结果按式（1）计算供检测的种子粒数—无特征性条带的种子粒数品种纯度（%）=×100………………（1）供检测的种子粒数9结果报告按GB/T3543.5规定执行。附录A（提示的附录）不同水稻的杂交种及亲本对应引物的设计与选择引物编号碱基组成用途RSP01正向：23bp反向：23bp鉴定协优64RSP02正向：25bp反向：28bp鉴定珍汕97BRSP03正向：24bp反向：24bp鉴定汕优97ARSP04正向：24bp反向：23bp鉴定汕优63RSP05正向：22bp反向：23bp鉴定明恢63RSP06正向：25bp反向：27bp鉴定协青早ARSP07正向：24bp反向：22bp鉴定协青早BRSP08正向：25bp反向：25bp鉴定协优63RSP09正向：24bp反向：26bp鉴定汕优64RSP10正向：25bp反向：25bp鉴定测64RSP11正向：23bp反向：23bp鉴定汕优晚3RSP12正向：27bp反向：25bp鉴定晚3