石蜡组织切片实验操作练习详细指导

石蜡切片实验操作练习详细指导提供给实验室的实验用品及每个小组的用量：1、器材切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。2、试剂卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿，1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。3、材料鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。4、每个实验小组的用量(一)器材切片机，切片刀，温台，恒温箱，熔蜡炉，水浴锅等这类几个小组用一台就行；解剖刀，单面刀片，小台木，毛笔一只，蜡铲一个，盖玻片和载玻片30个，脸盆一个，酒精灯各一个，包埋纸盒2~3个，染色缸一个，瓷杯3个，显微镜一台。（二）试剂FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片剂数滴，中性树胶数滴。（三）材料小白鼠一只、蚕豆种，小麦和大豆种10~20粒，洋葱和大蒜由实验室统一种，然后取其所需部分。石蜡切片法实例（一）—苏木精-伊红对染法一、目的要求1、熟悉石蜡切片的制作过程。2、掌握HE染色的基本原理和染色方法。二、实验原理石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。三、实验用品（一）器材切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。（二）试剂卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。试剂配法：1、卡诺氏固定液：100%酒精3份冰醋酸1份或：100%酒精6份氯仿3份冰醋酸1份2、埃利希苏木精染液的配法：苏木精1g纯酒精50ml冰醋酸5ml甘油50ml钾矾（硫酸铝钾）约5g（饱和量）蒸馏水50ml配法：ⅰ、将苏木精溶于约15ml的纯酒精中，再加冰醋酸后搅拌。ⅱ、当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器，同时加入其余的酒精。ⅲ、将钾矾在研钵中研碎并加热，然后将它溶解于水中。ⅳ、将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中，并随时搅动。ⅴ、此液混合完毕，将瓶口用一层纱布包着小块棉花塞起来，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约3~4周。若加入0.2g碘酸钠，可立刻成熟。此液稳定而染色均匀，染核效果良好，不会发生沉淀，长期贮备无妨。此液可分别与伊红等进行二重染色。3、1%伊红酒精溶液：伊红1g溶于100ml95%酒精溶液。4、1%盐酸乙醇液盐酸1份70%酒精100份5、甘油蛋白贴片剂：蛋白50ml甘油50ml水杨酸钠（防腐剂）1g配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。（三）材料鼠肝三、实验程序1、取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10mm×10mm×2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2~3mm厚。取材的注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2、固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。固定的注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。1、洗涤材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。2、脱水30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两面三刀次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。脱水注意事项（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象5、透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。透明注意事项（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。（3）在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。6、透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。透蜡注意事项（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。1、包埋将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。包埋的操作过程包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。2、切片①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。3、贴片①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。10、脱蜡复水石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸馏水中3min。染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。11、染色切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。12、水洗用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。13、分化就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。14、漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。15、脱水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。16、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。17、脱水Ⅱ放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。18、透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯