第十章---有机酸发酵工程

1第十章有机酸发酵艺2第一节概述有机酸：给出氢离子的有机物，是生物代谢的主要物质。泛指:羧酸（R-COOH）、磺酸（R-SO2OH）、亚磺酸（R-SOOH）、硫代羧酸（R-COSH）3羧酸（R-COOH）种类多：一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸、多元羧酸,不饱和羧酸4有机酸生产现状•广泛存在于植物果实中，提取不能满足需要。•合成法不被人们所接受•发酵法生产的有机酸接近自然产物，对人体有益。•糖、淀粉、酒精、石油等均可经微生物转化生成各种有机酸。由微生物发酵产生的有机酸有60多种。我国已经投产：柠檬酸、葡萄糖酸、长链二羧酸、曲酸等。5生产有机酸的菌种柠檬酸Aspergillusniger（黑曲霉）葡萄糖酸Aspergillusniger（黑曲霉）醋酸Acetobacteraceti（醋化醋杆菌）乳酸Lactobacilusdelbrackii（德氏乳杆菌）α-酮戊二酸Candidasp.（一种假丝酵母）衣康酸等Aspergillusterreus（土曲霉）水杨酸Pseudomonasaeruginosa（铜绿假单胞菌）丙酸Propionibacteriumshermanii(谢氏丙酸杆菌)6有机酸应用1.在食品和饮料中的应用酸味剂:汽水、硬糖、冰淇淋水果罐头、果冻、果酱保色作用抑制腐败微生物生长72.在医药工业中的应用•柠檬酸及钠盐是很好的抗凝血剂•葡萄糖酸钙补钙83.在化学工业中的应用洗涤剂（脱锈）:无毒、无污染柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液用于烟气脱硫。柠檬酸用于电厂大型高压锅炉清洗，代替价格昂贵的羟基乙酸-甲酸清洗工艺，已有成功经验，清洗效果很好。无毒电镀:柠檬酸盐镀锌溶液代替氰化物化妆品、香皂沐浴液:防止氧化和除臭94.其它工业卷烟(乳酸或乳酸钠):防干燥、防霉变、增香。柠檬酸三丁酯(TBC)和乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)可用于食品(包括肉类)包装的PVC增塑剂，美国食品与药品管理局(FDA)已批准柠檬酸三乙酯作为无毒增塑剂，用于食品包装、医疗器具、儿童玩具及个人卫生用品。柠檬酸三乙酯还可用作纤维素树脂的增塑剂等，开发前景不错。10欧洲、澳洲已规定3岁以下(日本规定6岁以内)儿童玩具不得使用含苯增塑剂，而TBC与ATBC是苯二甲酸酯类增塑剂(DOP)的最佳替代品。11我国对DOP的用途尚无限制，连医用液管也仅规定食用级DOP，今后国家一旦有禁用规定，市场将大增。12服装的甲醛污染已是很敏感的问题，柠檬酸和改性柠檬酸可制成一种无甲醛防皱整顿剂，用于纯棉织物的防皱整理。不仅防皱效果好，而且成本低。13第二节柠檬酸发酵柠檬酸（citricacid）,枸橼酸学名：3-羟基-3-羧酸戊二酸COOHHOOCCH2CCH2COOHOH14柠檬酸生产历史及现状1893年前，主要从柑橘、菠萝和柠檬等提取1893年后发现微生物（青霉）可产生柠檬酸世界上最早的发酵法柠檬酸生产是1923年的比利时，采用浅盘法发酵生产。151951年美国Miles公司首先深层发酵法生产柠檬酸（Aspergillusniger）我国20世纪40年代初开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代深层发酵。16目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势在于：（1）我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。17（2）尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外的单边发酵周期还要短。（3）柠檬酸的产酸速度大大高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍。18一、柠檬酸生产菌青霉、毛霉、木霉、曲霉等利用淀粉质原料大量积累柠檬酸国内利用黑曲酶（Aspergillusniger）工艺:固体或液体深层发酵原料:甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、玉米等19二、柠檬酸的生物合成途径葡萄糖丙酮酸丙酮酸+CO2固定反应草酰乙酸乙酰辅酶A柠檬酸合成酶柠檬酸顺乌头酸酶异柠檬酸20按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。21三、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成。22研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸。23柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。24Mn+缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。25该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。2.顺乌头酸酶活性的控制26因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。273.能荷调节对柠檬酸发酵的影响菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通。28在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。29如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。而实际上，确实柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。30为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。31后来的大量的实验证明，在某些微生物体内确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间，则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。32因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。33四、柠檬酸产生菌的育种柠檬酸发酵和其他代谢控制发酵一样，都是在环境水平上的代谢控制发酵，亦即，选育有代谢技能的突变株，在有控制的培养基上，在有选择的条件下，才能大量合成产物。因此菌种的选育是非常重要的，根据菌种选育的方法不同可以分为：分子生物学水平上的菌种选育和传统的菌种选育。34传统的方法：1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3诱变后，涂布，透明圈大的则好。2.现色圈大小平板：麦汁培养基+pH值指示剂诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。353.不分解柠檬酸的菌株不利用柠檬酸为碳源进行生长的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后述的酶的活性较低，或者丧失，这有利于柠檬酸的积累。方法：以柠檬酸为唯一的碳源的培养基上，选择生长不好的突变株。364.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。37五、发酵20世纪20年代的由青霉和曲霉的表面发酵为第一阶段，30年代开始的曲霉深层发酵生产为第二阶段；从50年代至今以曲霉深层发酵为主，并行着表面和固体发酵工艺为第三阶段。但其中还有着含糖基质发酵与烷烃类基质发酵之分。38（一）表面发酵表面发酵是利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵形式。1923年年首先由美国Pfizer公司实现工业化，至今仍在沿用，主要采用糖蜜原料发酵。39具体过程如下：•首先将糖蜜中的有害物质除去，再加入必要的营养盐并蒸煮灭菌；•调pH至2.2或稍低一点，将该灭菌的培养基放入高度为10-25cm的平面盘中，置于事先经一定消毒的发酵室中发酵培养。•培养温度为28-30℃，真菌在平面浅盘上很快形成彼此连接的菌丝体。发酵过程中，向培养室内吹入相对湿度为45%-60%的无菌空气。40•2-4天后，柠檬酸快速形成，7-10天发酵结束。表面培养法产酸率一般为15-20%，糖转化率为70-95%。•将发酵结束的发酵液抽出，加CaCO3产生柠檬酸钙沉淀下来。采用表面发酵，每平方米浅盘每天大约可生产1kg含一个水分子的柠檬酸。41（二）固体发酵1935年Cahn首先发明了这种方法，但由于其劳动强度太大，未引起重视。1953年日本率先实现工业化，我国的以薯干渣为原料的固体发酵工艺是于1977年成功投产的。固体发酵又有薄层发酵法和厚层通风发酵法之分。421、薄层发酵法固体发酵过程，对温度和湿度的控制非常重要。•曲醅入室的品温在30-35℃，在孢子发芽和菌丝开始发育时代谢热很少，品温逐渐下降，在此前18h内，品温应维持在27-31℃。43•18-48h内由于代谢热大量释放，品温可维持在30-43℃，但不得更高。•48h后品温很快降至35℃，直至发酵结束。44上述适宜的品温主要通过室温加以控制，一般室温控制在26-30℃，而任其品温自然变化，但一般不能超过40℃。上下曲盘具有温差所以在发酵40h左右要把上下曲盘对调一下。为减少这种温差，上盘曲层的厚度可以小于下层，整个发酵期内不必翻曲。温度控制方法45湿度控制方法曲房温度提高可以减少水分蒸发，但湿度太大易生毛霉，所以发现毛霉污染不能加大湿度。一般相对湿度在85%-90%即可。46•发酵过程是否正常，开始主要靠观察菌丝体的长势；•接种20h,可见白色菌丝变成黄色；•36h可见细小灰白色孢子头，孢子梗长达2mm；•48h孢子转棕色，以后色度逐渐加深。曲醅在发酵过程中体积逐渐收缩，紧密结块。判断发酵过程是否正常的标准47判断发酵终点的指标发酵终点——出曲时间由产酸决定，测定由48h开始，每12h小时测一次，72小时后每4小时测一次，在酸度最高时出料，否则时间拉长柠檬酸反而被菌体分解。48出现杂菌污染采取的措施如出现杂菌污染时，应根据杂菌的扩展情况提前出曲。芽孢杆菌显著污染时要立即出曲。如果感染的是生长缓慢的青霉，但酸度仍在升高，可暂缓出曲，否则立即出曲。492、厚层通风发酵固体厚层发酵是在薄层发酵的基础上发展起来的。它的特点是必须由容器的底部向上通风，以供给氧气和带走热量，机械化程度可以提高。这种工艺目前仍在日本占主要地位，但日本主要在设备方面作了改进，实现了发酵密闭化，操作机械化和部分自动化。50（三）深层发酵深层发酵是菌体在液体培养基中，在通气的条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。该工艺是美国的Miles公司首先成功工业化的，并被当今普遍应用。51我国薯干粉深层发酵工艺相当