DB11-T 375-2006 水生动物检疫名录及病原检测方法

ICS65.150B50备案号：19166-2006北京市地方标准DBDB11/T375—2006水生动物检疫名录及病原检测方法AquaticAnimalQuarantineDirectoryandDiseaseInspectionMethod2006-07-25发布2006-10-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T375—2006I前言本标准以《中华人民共和国动物防疫法》、《中华人民共和国渔业法》、《中华人民共和国动物防疫法一、二、三类动物疫病病种名录》、《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》、《国际水生动物卫生法典》为基础，参考中华人民共和国动物疫病的防疫检疫相关法律、法规和相关标准，并结合北京市水产养殖业的特点，强调了水产养殖生产和流通中，需要严格控制、检疫的疫病及其判定方法。本标准的附录A、B、C、D、E、F、G、H、I、J均为资料性附录。本标准由北京市农业局提出并归口本标准起草单位：北京市水产技术推广站本标准主要起草人：王姝、殷守仁、徐立蒲、盛竹梅、高南。DB11/T375—20061水生动物检疫名录及病原检测方法1范围本标准规定了北京市二、三类水生动物疫病名录、病原检测方法和报告单形式。本标准适用于北京地区各水产养殖单位、天然水域、垂钓休闲场所等，以及进出北京的鲜活水产品及产品。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.7-2003食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T15805.1-1995淡水鱼类检疫方法第一部分GB15984-1995霍乱诊断标准及处理原则水生动物疾病诊断手册世界动物卫生组织3检疫名录具体见表1。表1检疫名录疫病类别疫病名称1病毒性出血性败血症（VHS）2鲤春病毒血症（SVC）3传染性胰脏坏死病（IPN）4草鱼出血病（GCH）5传染性造血器官坏死病（IHN）6斑点叉尾鮰病毒病（CCVD）7对虾白斑病（WSS）8对虾拖拉病（TS）9弧菌病[霍乱弧菌（Vibriocholera）、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）]二类疫病（10种）10吸虫病[华枝睾吸虫（Clonorchissinensis）、并殖吸虫（Paragonlmuswestermanl）]1鲤痘疮病（疱疹病毒）（H.cyprini）2鳃霉病（鳃霉菌）（Branchiomycessp.）3气单胞菌病[嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、灭鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）]4小瓜虫病[多子小瓜虫（Ichthyophthiriasismultifiliis）、刺激隐核虫（Cryptocaryonirritans）]5绦虫病[九江头槽绦虫（Bothriocephalusgowkongensis）、阔节裂头绦虫（Diphyllobothriumlatum）]6粘孢子虫[碘泡虫（Myxobolusspp）、单极虫（Thelohanellidaespp）]7原虫病[斜管虫（Chilodonellacyprini）、车轮虫（Trichodinaspp）]8蠕虫病[指环虫（Chilodonellacyprini）、三代虫（Gyrodactylusspp）]三类疫病（9种）9昏眩病[脑粘体虫（Myxosomacerebralis）]4检测方法DB11/T375—20062检测方法具体见表2和表3。表2二类疫病检测方法序号疫病名称检测方法1病毒性出血性败血症（VHS）GB/T15805.1-19952鲤春病毒血症（SVC）GB/T15805.1-19953传染性胰脏坏死病（IPN）GB/T15805.1-19954草鱼出血病（GCH）自行制定，见附录A5传染性造血器官坏死病（IHN）GB/T15805.1-19956斑点叉尾鮰病毒病（CCVD）GB/T15805.1-19957对虾白斑病（WSS）《水生动物疾病诊断手册》8对虾拖拉病（TS）《水生动物疾病诊断手册》霍乱弧菌（Vibriocholera）GB15984-19959弧菌病副溶血弧菌（vibrioarahaemolyticus）GB/T4789.7-2003华枝睾吸虫（Clonorchissinensis）10吸虫病并殖吸虫（Paragonlmuswestermani）自行制定，见附录B表3三类疫病检测方法序号疫病名称检测方法1鲤痘疮病（疱疹病毒）（H.cyprini）自行制定，见附录C2鳃霉病（鳃霉菌）（Branchiomycessp.）自行制定，见附录D嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）自行制定，见附录E3气单胞菌病灭鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）GB/T15805.1-19954小瓜虫病自行制定，见附录F5绦虫病自行制定，见附录G6粘孢子虫病自行制定，见附录H7原虫病自行制定，见附录I8蠕虫病自行制定，见附录J9昏眩病GB/T15805.1-19955出具报告单具体见表4。DB11/T375—20063表4病原检测报告单报检单位编号送检单位编号实验室编号送样单位样品名称产地取样部位送样日期细菌检测项目□霍乱弧菌□副溶血弧菌□嗜水气单胞菌□灭鲑气单胞菌病毒检测项目□病毒性出血性败血症□鲤春病毒血症□传染性胰脏坏死病□草鱼出血病□传染性造血器官坏死病□斑点叉尾鮰病毒病□对虾白斑病□对虾拖拉病□鲤痘疮病（疱疹病毒）霉菌检测项目□鳃霉病寄生虫检测项目□华枝睾吸虫□单极虫□并殖吸虫□斜管虫□多子小瓜虫□车轮虫□刺激隐核虫□指环虫□九江头槽绦虫□三代虫□阔节裂头绦虫□脑粘体虫□碘泡虫结果报告备注DB11/T375—20064附录A（资料性附录）草鱼出血病的检测A.1病原该病毒属呼肠孤病毒科，介于呼肠孤病毒属和轮状病毒属之间。A.2流行情况此病在南方多个省市均有流行，草鱼、青鱼都可发病，特别是在苗种培育阶段危害性更大。它流行季节长，发病率高，往往造成大批草鱼鱼种死亡。A.3临床检查A.3.1活动情况及外部检查鱼的体色变黑，离群独游，停止摄食，还伴有充血、出血症状。A.3.2剖检病鱼各器官组织有不同程度的充血、出血。口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖、鳃及鳍条基部充血，有时眼球突出；剥除鱼的皮肤，可见肌肉呈点状或块状充血、出血，严重时肌肉呈鲜红色，这时鳃常呈现“白鳃”；肠壁充血，但仍具韧性，肠内无食物；肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、脾、肾也有出血点或血丝。A.4实验室检验A.4.1病毒分离A.4.1.1细胞准备A.4.1.1.1设备及器械无菌室、超净工作台、恒温培养箱、低温冰箱和0.45um混合纤维素酯微孔滤膜、细胞培养瓶、白色橡皮塞等。A.4.1.1.2培养基及试剂细胞生长液、胰酶—EDTA混合消化液、小牛血清、L-谷氨酰胺等。A.4.1.1.3接种前的细胞准备草鱼出血病毒用草鱼肾细胞株（CIK）细胞分离。最适培养温度分别为20℃左右。选择生长良好，形成单层的细胞培养物，倒出生长液加入适量胰酶－EDTA混合消化液消化，然后补加生长液，按1：2或1：3的分种率将原瓶消化的细胞分装入2个或3个培养瓶中，置室温中继续培养，当单层致密度达80%左右，即可用于病毒接种。A.4.1.2样品接种A.4.1.2.1设备及器械除了A.4.1.1.1规定的设备及器械外，另增加冷冻离心机和1.2mL规格的移液管。A.4.1.2.2常用的溶液细胞维持液、磷酸缓冲盐水等。A.4.1.2.3取样有症状的鱼，取10尾以上样品作病毒分离用。无症状的鱼，取60尾以上样品作病毒分离用。DB11/T375—20065对鱼卵，取60～100粒为样品作病毒分离用。对于少量成鱼，从尾动脉抽1～2mL血液，其血浆作病毒分离用，血清作抗体检测。A.4.1.2.4样品处理——较大的鱼取其肾、肝、脾等内脏器官。仔、稚鱼取鱼体全部。鱼卵必须去除卵黄囊。——称重，加磷酸缓冲盐水（PBS）匀浆，并稀释成10-1，离心30min（4,000rpm），弃去沉淀物，将上清液通过0.45um微孔滤膜除菌，然后再用PBS进行10倍稀释，即成样品。——血液样品置于常温下1h后，再放在4℃下12h以上，以析出血清。然后低速离心，其沉淀作待检样品，按上述方法制备样品液，血清作中和试验。A.4.1.2.5接种细胞倒出细胞瓶中的培养液，然后接种样品液，接种量为维持液量的10-1，吸附1h后，加细胞培养液培养，同时设对照。A.4.1.3病毒培养草鱼出血病毒培养温度是15℃～20℃。在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察7d后，盲传二代。A.4.1.4结果观察若接种样品含有病毒，培养2d～5d后，即出现明显细胞致病变作用（CPE），主要特征为细胞崩解，细胞单层破坏。收集阳性细胞悬液，冻融一次后，低速离心除去细胞碎片，上清液作病毒鉴定用。若接种后7d仍未见CPE，则判断为阴性结果。若7d内出现可疑CPE现象，则需将该细胞瓶培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有CPE。A.4.2病毒鉴定A.4.2.1中和试验I（固定血清用量——稀释病毒法）本试验用于鉴定在细胞培养中出现了CPE的样品是否含有草鱼出血病毒。A.4.2.1.1试验准备——细胞CIK细胞培养于96孔微量细胞培养板上。——病毒用草鱼出血病毒标准毒株，传代后制成病毒悬液。——标准抗血清抗草鱼出血病毒的标准血清，使用前于56℃灭活60min。——待检样品（出现了CPE的细胞培养物）冻融一次，除去细胞碎片后使用。A.4.2.1.2操作步骤A.4.2.1.2.1将待检样品用Hanks液作系列稀释，使其稀释度由10-1到10-3，每管含量为0.5mL。A.4.2.1.2.2取两排试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2mL于两排试管中，然后第一排试管加入0.2mL抗草鱼出血病毒标准血清，第二排试管加入0.2mL维持液，充分混合均匀。A.4.2.1.2.330℃温育60min。A.4.2.1.2.4温育后分别将第一排管和第二排管的样品接种于已长满草鱼出血病毒细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.1mL。A.4.2.1.2.5将抗草鱼出血病毒标准血清倍比稀释后（1：8至1：64）接种于上述培养板，每个稀释度4孔，每个孔0.05mL，作为标准血清对照。将标准草鱼出血病毒接种8孔，每孔0.05mL，作为病毒对照，其余8孔作为正常细胞对照。A.4.2.1.2.6每孔加入维持液至总量0.2mL。A.4.2.1.2.7放入20℃培养箱中培养，逐日观察病变，记录结果（按附表A.1填写）。DB11/T375—20066表A.1中和试验I结果记录表待检样品-标准血清待检样品-维持液标准血清草鱼出血病毒对照细胞对照行列123456789101112A10-1B10-21:8C10-3D10-41:16E10-5F10-61:32G10-7H10-81:64A.4.2.1.3结果判定按Reed和Muench法分别结算出待检样品——标准血清与待检样品——维持液的细胞半数致死量（TCID50），二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与标准血清对照为阴性，标准毒对照为阳性，按表A.2判定结果。表A.2结果判定中和指数结果判定10阴性（待检者不带毒）10～50可疑50阴性A.4.2.2中和试验II（固定病毒——稀释血清法）本试验用于鉴定鱼血清中是否含有抗草鱼出血病毒的中和抗体。A.4.2.2.1试验准备——细胞CIK细胞培养于96孔微量细胞培养板上。——病毒标准草鱼出血病毒，使用前用Hanks液稀释至50TCID50/0.1mL。——血清待检血清和正常血清（阴性血清）用等量的Hanks液（每毫升含青霉素200IU、链霉素200mg）稀释后，于45℃灭活30min，待冷却后使用。A.4.2.2.2操作步骤A.4.2.2.2.1将