NYT 2070-2011 牛初乳及其制品中免疫球蛋白lgG的测定 分光光度法

ICS67.100.01X16中华人民共和国农业行业标准NY/T2070-2011牛初乳及其制品中免疫球蛋白lgG的测定分光光度法DeterminationofimmunoglobulinGinbovinecolostrumanditsproducts—Spectrophotometry2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T2070-2011前言本标准按照GB／T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC／TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、东北农业大学。本标准主要起草人：邵华、金茂俊、姜瞻梅、金芬、肖航、杨锚、王静、刘宁。ⅠNY/T2070-2011牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定分光光度法1范围本标准规定了牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定方法。本标准适用于牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定。本方法检出限：0.2mg／mL。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB／T6682分析实验用水规格和试验方法3原理试样中可溶性抗原IgG与抗体形成可溶性免疫复合物，复合物在聚乙二醇作用下自液相析出，形成微粒，使试液浊度发生变化，试液浊度与所含IgG抗原量成正比，在340nm测定免疫球蛋白IgG含量。4试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。实验用水应符合GB／T6682规定的二级水要求。4.10.01moI／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)取0.7g磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.86g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，0.20g氯化钾(KCl)，8.80g氯化钠(NaCl)，水溶解后调pH至7.4，用蒸馏水定容至1000mL，置4℃保存。4.24%聚乙二醇缓冲液取40g聚乙二醇，加磷酸盐缓冲液(4.1)定容至1000mL，置4℃保存。4.3IgG标准贮备液称取0.010gIgG标准品，精确至0.0001g，用磷酸盐缓冲液(4.1)溶解并定容至10.0mL，摇匀。此标准贮备液质量浓度为1.0mg／mL，置－18℃保存备用。4.4IgG标准系列溶液取IgG标准贮备液，用4%聚乙二醇缓冲液稀释(4.2)，配制浓度为0.20mg／mL、0.30mg／mL、0.40mg／mL、0.50:mg／mL、0.60mg／mL、0.70mg／mL和0.80mg／mL的IgG标准系列溶液，临用时配制。4.5抗IgG抗体贮备液取10mg兔抗牛IgG抗体粉剂（效价≥10000）溶于2mL的磷酸盐缓冲液(4.1)中，每管分装成100µL，置-18℃保存备用。4.6抗IgG抗体稀释液取100µL的抗体贮备液，加入4.9mL的聚乙二醇缓冲液(4.2)，将抗体稀释50倍。临用时配制。5仪器与设备5.1紫外分光光度计，340nm，配有微量比色皿。5.2微量移液器。1NY/T2070-20115.3反应管，0.5mL。5.4冷冻离心机。5.5分析天平，感量0.1mg和0.01g。5.6恒温水浴锅。6分析步骤6.1试样制备6.1.1液态牛初乳取2.0mL液态牛初乳试样于离心管中，在1℃～5℃、5000r／min条件下离心30min。去上层脂肪，取1.0mL脱脂牛初乳试样，用4%聚乙二醇缓冲液(4.2)稀释至100mL～200mL，混匀，备用。6.1.2固态牛初乳将固态牛初乳样品粉碎后，称取0.2g试样，精确至0.001g，加2.0mL水，混匀，1℃～5℃、5000r／min条件下离心30min。去上层脂肪，取1.0mL脱脂牛初乳试样，用4%聚乙二醇缓冲液(4.2)稀释至50mL～100mL，混匀，备用。6.2测定6.2.1标准曲线的绘制向各个反应管中加入250µL的抗IgG抗体稀释液(4.6)，再分别取10µL浓度为0.20mg／mL、0.30mg／mL、0.40mg／mL、0.50mg／mL、0.60mg／mL、0.70mg／mL、0.80mg／mL的IgG标准系列溶液(4.4)依次加入各反应管中，混匀后，置于37℃水浴中反应40min。以4%聚乙二醇缓冲液(4.2)进行调零，在340nm波长下测定吸光值，以标准溶液浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。6.2.2试样的测定向各个反应管中加入250µL的抗IgG抗体稀释液(4.6)，再取10µL待测试样加入各反应管中，混匀后，置于37℃水浴中反应40min。以4%聚乙二醇缓冲液(4.2)调整分光光度计的零点，在340nm波长下，测定吸光值。根据标准曲线，计算待测试样中IgG含量。6.3空白实验采用脱脂乳为空白样品，按照6.1和6.2.2的步骤进行操作。7结果计算试样中IgG的含量以质量分数ω计，单位为克每百克(g／100g)或克每百毫升(g／100mL)表示，按式(1)计算：21001000Vmρω×××=×……………………………………………(1)式中：m——试样的质量或体积，单位为克(g)或毫升(mL)。ρ——被测液中IgG的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg／mL)；V——试样稀释后的体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留两位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。2