DB33 T 783-2010 脱毒芋艿种芋(苗)病毒检测技术规程

ICS65.020.01B15浙江省地方标准DB33DB33/T783—2010脱毒芋艿种芋（苗）病毒检测技术规程Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)taros2010-04-07发布2010-05-07实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T783—2010I前言本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江大学生物技术研究所、台州市农业科学研究院、金华市农业科学研究院、永康市农业技术推广中心。本标准主要起草人：毛碧增、陈银龙、张尚法、成其仓、胡明龙。DB33/T783—20101脱毒芋艿种芋（苗）病毒检测技术规程1范围本标准规定了脱毒芋艿（ColocasiaesculentL.）种芋(苗)的术语和定义、检测对象、质量要求、检验方法和检验规则。本标准适用于脱毒芋艿种芋（苗）的病毒检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T401-2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程NY/T402-2000脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1脱毒核心种苗通过植物组织培养技术获得的，经检测不带芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus,DsMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的种苗。3.2扩繁脱毒苗由脱毒核心种苗经组织培养繁殖获得的苗。3.3脱毒种芋由扩繁脱毒苗繁育，经种芋生产体系生产出来的，分脱毒原原种芋、脱毒原种芋和生产用脱毒种芋。3.4脱毒原原种芋扩繁脱毒苗在容器内生产的和在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.5脱毒原种芋脱毒原原种芋在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.6生产用脱毒种芋由脱毒原种芋在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.7脱毒率不带指定病毒的种芋（苗）数占所检测种芋（苗）总数的百分比。DB33/T783—201024检测对象芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。5质量要求脱毒核心种苗、扩繁脱毒苗和脱毒原原种芋脱毒率：100%。脱毒原种芋脱毒率：≥98%。生产用脱毒种芋脱毒率：≥95%。6检验方法6.1电镜检测法6.1.1负染色法用于检验芋花叶病毒（DsMV），检测方法按附录A执行。6.1.2超薄切片法用于检验芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV），检测方法按附录B执行。6.2双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)采用芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）商品检测试剂盒，进行DAS-ELISA检测，检测方法按NY/T401-2000中附录A的方法执行。7检验规则7.1组批同一时间，同一地点，取得同一品种不同单株的脱毒种芋（苗）为同一组批。7.2抽样方案7.2.1脱毒核心种苗每株必须检测。7.2.2扩繁脱毒苗随机抽取1%～2%检测。7.2.3脱毒原原种芋和脱毒原种芋幼苗期、球茎膨大期和收获前两周，采用五点取样法。种植面积：≤0.1hm2取样200株；0.11hm2～1hm2取样500株；≥1hm2，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取叶片1g～5g，4℃冰箱保存，24h内检测。7.2.4生产用脱毒种芋球茎膨大期，采用随机取样法，抽样方法按NY/T402-2000的4.2.2执行。7.3判定规则当检验批满足质量要求时，判该批产品合格，并附芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告（参见附录C）。DB33/T783—20101附录A(规范性附录)负染色检测法A.12%磷钨酸负染色液（PTA，pH6.7）磷钨酸2g用双蒸馏水定容至100mL，1mol/L的NaOH调pH至6.7。A.2操作步骤A.2.1研磨取新鲜叶片1g～5g，加双蒸馏水充分研磨，获得组织汁液。A.2.2蘸样用铜网有膜的一面蘸取组织汁液，停留1min～2min后用滤纸吸去多余汁液。A.2.3负染色铜网经2%磷钨酸负染色1min后，吸去多余染色液，室温下晾干。A.2.4电镜观察铜网置于透射电镜下观察，芋花叶病毒（DsMV）为马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，病毒粒子线状、略弯曲，长约750nm。DB33/T783—20102附录B(规范性附录)超薄切片检测法B.1溶液配置所有化学试剂为分析纯，双蒸馏水配置。B.1.12.5%戊二醛固定液0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）50mL25%戊二醛10mL加双蒸馏水至100mL。B.1.21%四氧化锇固定液2%四氧化锇水溶液：将0.5g或1g装四氧化锇的安瓿瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶中，在排毒柜内把安瓿瓶敲破，即刻加入双蒸馏水，配制成2%水溶液，盖上盖子，溶解1d。1%四氧化锇固定液：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）5mL2%四氧化锇水溶液5mLB.1.3醋酸双氧铀染色液醋酸双氧铀2g50%乙醇100mL充分摇动10min，静置1d～2d，使未溶解部分自然沉淀，取上清液使用。溶液呈鲜黄色，溶液宜用棕色瓶避光保存。B.1.4柠檬酸铅染色液硝酸铅1.33g柠檬酸三钠1.76g双蒸馏水30mL将上述成分放在50mL容量瓶中，用力振荡30min，使溶液呈乳白色，加入1mol/LNaOH8mL，溶液变透明，再加双蒸馏水定容50mL。B.2操作步骤B.2.1取样叶片切成1mm2～2mm2小块。B.2.2固定用2.5%戊二醛固定液于4℃冰箱中固定1h～2h，经0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）漂洗后，在室温下用1%的四氧化锇固定液固定1h～2h。B.2.3脱漂和洗水经0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）漂洗1h，中间换液4次；用体积分数为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脱水各15min（4℃）；室温下丙酮置换2次，各30min。B.2.4包埋和聚合用Spurr低粘度环氧树脂进行渗透和包埋，分别用包埋剂：丙酮=1：1渗透1h，包埋剂：丙酮=1：3渗透3h后，置换新管，纯包埋剂渗透过夜。用纯包埋剂包埋后70℃聚合8h。B.2.5超薄切片包埋好的样品修块后，在超薄切片机上切成70nm～90nm的切片。DB33/T783—20103B.2.6电子染色超薄切片分别经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色液各染色15min。B.2.7电镜观察透射电镜下观察芋花叶病毒（DsMV）的线状粒子和风轮状内含体分布在细胞质中。黄瓜花叶病毒（CMV）的球状粒子分布在细胞质及液泡中。DB33/T783—20104附录C（资料性附录）芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告参见表C.1。表C.1芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告送样单位：品种名称：原种采集地：送样时间：原种数量:编号：编号芋花叶病毒（DsMV）黄瓜花叶病毒（CMV）注：病毒检测结果“+”表示阳性带毒，“-”表示阴性不带毒检测单位：质检员（签字）：检测日期：