DB51 T 875-2009 水稻稻瘟病菌对稻瘟灵抗药性室内测定技术规程

65.020.20B16DB51四川省地方标准DB51/T875—2009水稻稻瘟病菌对稻瘟灵抗药性室内测定技术规程RuleofResistantAssessmentofPyriculariagrisea（Cooke）Sacc.toIsoprothiolaneintheLaboratory2009-03-05发布2009-03-10实施四川省质量技术监督局发布49DB51/T875—2009I目次前言......................................................................II1范围.....................................................................12规范性引用文件...........................................................13.原理.....................................................................14术语和定义...............................................................15试剂与材料...............................................................36仪器与用具．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37测定方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．48数据统计与分析......................................................................49原始记录和报告的形成及归档．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5附录A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6附录B．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6附录C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7DB51/T875—2009II前言本标准附录A、附录B是规范性附录，附录C是资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省农业科学院植物保护研究所、四川省农业厅植物保护站。本标准主要起草人：席亚东、彭丽年、刘波微、蔡方凯、彭化贤DB51/T875—20091水稻稻瘟病菌对稻瘟灵抗药性室内测定技术规程1范围本标准规定了水稻稻瘟病菌(Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc.)对稻瘟灵抗药性室内测定技术方法,包括水稻稻瘟病菌的室内分离和抗药性评价。本标准适用于水稻稻瘟病病原菌室内对稻瘟灵抗药性评价。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改条款（不包括勘误的内容）或修改版均不适用于本标准，然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本均适用于本标准。本文没有规范性引用文件。3原理稻瘟灵能够抑制稻瘟病菌生长,起到预防与治疗作用，一般采用生长速率法测定稻瘟病菌对稻瘟灵的抗药性。生长速率法的原理是将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带药培养基平板，在平板上接种病原菌，以病菌生长速率的快慢来判定药剂毒力大小。4术语和定义以下术语和定义适用于本标准。4.1水稻稻瘟病RiceBlast由无性世代为半知菌亚门梨孢属（Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc.）、有性世代为子囊菌亚门真菌Magnaporthe属（Magnaporthegrisea（Hebert）Barr.）所引起的水稻病害。2.14.2生长速率法Growthratemethod指测定菌丝生长快慢的方法，通常是用在单位时间内菌丝在适宜的平板培养基上在适宜的条件下的生长量来表示。药剂处理菌落直径－菌块直径菌丝生长抑制率（%）=(1－—————————————————)×100对照菌落直径－菌块直径DB51/T875—200924.32.2分离菌Isolate2.3采用人工方法分离获得的病原物的纯培养菌。2.44.4原药Technicalgradematerial未经加工的农药原产物。4.52.5药基培养基Medicinemedium将实验药剂与培养基按一定比例混合，制成一种均匀的含有一定剂量药剂的培养基。4.6剂量反应曲线Dosagereactioncurve反映药剂对病菌抑制效果的反应曲线，常用公式表示:Y=a+bx其中:Y为抑制效果机率值,x为浓度对数，a、b分别为常数。4.7抑制中浓度（EC50）Medianeffectiveconcentration（EC50）指在试验时间内，药剂抑制50%菌丝生长或孢子萌发所需的药剂有效浓度。4.8敏感基线Susceptibletoxicitybaseline指对某种药剂对害虫或病原菌敏感品系毒力回归线的测定，敏感基线是比较抗药性有无和抗药性水平高低的标准。4.92.6敏感菌株susceptiblestrain在未接触过某种药剂的地区采集或在室内经多代隔离培养获得的菌株，即为对该药剂的敏感菌株。4.10抗性菌株Resistantstrain一般指长期施用杀菌剂，出现对某种药物反应敏感性降低的病原菌，即为对该药剂的抗性菌株。5试剂与材料除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂或蒸馏水或去离子水。5.1试剂DB51/T875—20093可溶性淀粉(C6H10O5)n,Starchsoluble酵母粉Yeastextractpowder琼脂Agar蒸馏水Distilledwater丙酮：分析纯（AR）稻瘟灵原药：有效成份≥90%。5.2药液配制5.2.1母液配制：称取一定的原药(精确至0.0001g)，置于容量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度定容，摇匀备用。5.2.2供试药液浓度：根据实验设计配制5个～6个药液质量浓度梯度，推荐浓度梯度5个：40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL。试验药剂计算方法及母液取用方法见附录A。5.3药基培养基配制根据试验要求，将配制好的稻瘟灵供试药液按浓度梯度分别和水稻培养基混合（13.5mL培养基中加入1.5mL药液的药基培养基），最终分别配成40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL的药基培养基。6仪器及用具超净工作台、生化恒温箱、冰箱、电子天平、高压消毒锅。电炉、微量可调移液器（200μL～1000μL、1mL～5mL）、酒精灯、吸管、三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿（直径为90mm）、刻度试管、手术刀或剪刀、镊子、接菌针、打孔器等。7测定方法7.1稻瘟病菌样品的采集在水稻乳熟期～腊熟期，在稻瘟病发生田里采集带有穗颈瘟的稻秆，装入纸质袋内，自然干燥，记载采集地点、时间、品种名称和采集人。稻瘟病穗颈瘟田间症状见附录C。7.2稻瘟病菌的分离和培养稻瘟病病原菌必须是从当年采集样品中分离获得的分离物。用清水将病稻秆表面洗净，放入培养皿内保湿培养12h～24h，保湿温度26℃±1℃，待从病斑上长出分生孢子梗和分生孢子后，在超净工作台上，用镊子将稻杆轻轻拿出，在装有培养基的培养皿上方轻轻抖动，连续在4个～5个培养皿上抖DB51/T875—20094动，将接有分生孢子的培养皿置于26℃±1℃的生化恒温箱内培养24h，再镜检，挑出单孢子萌发长出的菌丝于试管中，在26℃±1℃的恒温箱中培养，该菌即为稻瘟病的单孢子菌种。待长出菌落后移至到平板稻瘟病菌培养基中培养7d备用。稻瘟病菌培养基配置方法见附录B。7.3抗性测定采用生长速率法测定，用灭菌的打孔器将菌龄相同、培养7d的平板菌边缘打成直径为5mm的菌块，用接菌针挑取菌块，菌面向下置于不同浓度梯度的平板药基培养基中心，每皿1块，置于恒温箱（26℃±1℃）内培养，每个处理重复3次，以加入无菌水的培养基为空白对照。培养7d后，用十字交叉法测量菌落生长直径(mm)，计算菌丝生长抑制率。8数据统计与分析8.1计算方法及统计分析用十字交叉法测量菌落直径的平均值(mm)按依以下公式算出生长抑制率：药剂处理菌落直径－菌块直径菌丝生长抑制率（%）=(1－—————————————————)×100对照菌落直径－菌块直径将菌丝生长抑制率换算成抑制效果机率值(Y),药剂浓度换算成浓度对数(X)。按浓度对数与机率值回归法求得供试药剂对病原菌的剂量反应曲线Y=a+bx,并由剂量反应曲线计算试验药剂对病原菌的抑制中浓度EC50。8.2敏感基线的确立测定大量菌株的EC50，根据EC50值绘出菌株敏感性频率正态分布曲线，第一个正态分布曲线的中值即稻瘟病菌对稻瘟灵的敏感基线。8.3结果判定8.3.1抗性水平划分抗性水平＝供试菌株EC50/敏感基线。抗性水平≦1为敏感菌株；1抗性水平≦3为低抗菌株；3抗性水平≦10为中抗菌株；抗性水平10为高抗水平。8.2.2抗性评价根据抗性水平将参试菌株划分为敏感菌株和抗性菌株。再根据抗性菌株在群体中出现频率计算出抗性菌株频率。抗性菌株频率=抗性菌株/供试菌株×100。9原始记录和报告的形成及归档建立稻瘟病菌抗药性监测数据库，将测定的所有原始数据及计算结果按时间、地点建立档案，长期保存。DB51/T875—20095附录A（规范性附录）试验药剂计算方法原药取用量X1(g)按式(1)计算:C×V1×10-6X1=P…………..……………………………(1)式中：X1——原药取用量，单位mL；C——母液质量浓度，单位μg/mL；V1——母液体积，单位mL；P——原药浓度（有效成份），单位%。母液取用量X2(μg/mL)按式(2)计算:A×V2×10-6X2=C………..……………………………….(2)式中：X2——供试药液质量浓度，单位μg/mL；C——母液质量浓度，单位μg/mL；V2——药基培养基体积，单位mLA——试验浓度，单位μg/mL。DB51/T875—20096附录B（规范性附录）稻瘟病菌培养基配制方法2.7将20g琼脂条置于1000mL无离子水中，煮沸20min后待琼脂条完全溶化，经三层纱布过滤后，分别加入可溶性淀粉10g、酵母粉2g，待完全溶解，再将液体定容至1000mL，用pH试纸测定其pH，如果培养基偏酸或偏碱，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCL溶液进行调节，最终调节pH为7.3，装入三角瓶，在高压消毒锅中灭菌30min后备用。______________________DB51/T875—200972.8附录C2.9（资料性附录）2.10穗颈瘟田间症状描述穗颈瘟主要发生于主穗梗至第一枝梗分枝的穗颈部，初期发病形成褐色小点，扩展后病部成段变褐色坏死，易折断，可造成枯白穗。发病晚的造成秕谷。______________________