DB51 T 921-2009 水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程

165.020.99B19DB51四川省地方标准DB51/T921—2009水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程InspectionandIdentificationRulesofXanthomonasoryzaepv.Oryzae2009-03-05发布2009-03-10实施四川省质量技术监督局发布DB51/T921—2009I目次前言.................................................................................II1范围................................................................................12术语和定义..........................................................................13原理................................................................................144试剂与材料.........................................................................15仪器及用具..........................................................................26取样................................................................................27检验方法............................................................................28结果判断............................................................................29除害处理............................................................................3附录A（规范性附录）水稻白叶枯病间接ELISA检验程序..................................4附录B（资料性附录）水稻白叶枯病田间典型症状.........................................6DB51/T921—2009II前言本标准的附录A是规范性附录。本标准的附录B是资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：赵兰鸰、陈素清、帅波、吴志平、李耄、袁曦、万佳DB51/T921—20091水稻白叶枯病菌检验鉴定技术规程1范围本标准规定了水稻白叶枯病的取样方法、田间症状识别、实验室检验鉴定技术要求。本标准适用于水稻白叶枯病菌检验和鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准2.1水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Ishiyama)Dye)指引起水稻白叶枯病的病原细菌。属黄单胞杆菌属细菌。2.2噬菌体prophage是一种感染细菌和放线菌的病毒，本文特指侵染水稻白叶枯病菌的病毒。2.3噬菌斑plaque在培养基的菌苔上出现一个由于细菌被噬菌体裂解后造成的半透明的空斑，称噬菌斑。3原理水稻白叶枯病菌通过带菌种子远距离传播，该病菌属难以很快获得纯培养，且鉴定比较困难。因此，在鉴定时除了进行田间识别外，主要采取用噬菌体检测、血清学的酶联免疫法（ELISA）检测。噬菌体检测其原理是利用噬菌体的寄主专化性，细菌被噬菌体寄生后，细胞壁溶解或破裂，细菌消解，在固体培养基上出现半透明的圆斑－噬菌斑。通过噬菌斑的有无判断被检样品是否带菌。酶联免疫间接法（ELISA）检测的原理是利用水稻白叶枯病抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化反应，形成酶标记的特异性免疫复合物。当碱性磷酸酶标记的免疫复合物与相应底物结合，并催化无色底物生成有色产物，根据显色反应，判断被检样品是否带菌。44试剂与材料除非另有说明，在本标准中使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.1ELISA检验4.1.1样品提取液取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。4.1.2洗涤液取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.5g吐温－20，用1000mL蒸馏水溶解，并用氢氧化钠（NaoH）或盐酸（HCl）调整pH值到7.4。4.1.3封闭液取5g无脂奶粉（nonfatdriedmilk），用100mL样品提取液溶解。4.1.4包被液取2.93g碳酸氢钠（Na2HCO3）、1.59g氯化钠（NaCl）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并用氢氧化钠（NaoH）或盐酸（HCl）调pH值到9.6。4.1.5抗体稀释液取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。DB51/T921—200924.1.6抗体兔抗水稻白叶枯菌抗体球蛋白，按市售产品要求进行稀释。4.1.7酶标抗体市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白。4.1.8底物缓冲液用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁（MgCl2.6H2O）、0.02g叠氮化钠（NaN3）、9.7mL二己醇胺（CH2CH2OH）溶解后，调PH值到9.8，定容到100mL。4.1.9底物溶液将5mg对硝基苯磷酸盐（C6H5NO3）溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min内，避光条件下制备。4.1.10终止液将12g氢氧化钠（NaOH），用100mL蒸馏水溶解。4.1.11肉汁冻培养基3g牛肉浸膏、1g酵母浸膏、5g蛋白胨、10g葡萄糖（或蔗糖）、15g琼胶，用1000mL蒸馏水溶解，并用氢氧化钠（NaoH）或盐酸（HCl）调整pH值到7.0～7.5。5仪器及用具小型粉碎机、恒温箱、酶联板、微量移液器、手持放大镜、显微镜、载玻片、盖玻片、容器、吸水纸、小烧杯、酶标仪、培养皿等。6取样6.1叶片检验取样在水稻孕穗期前后，进行田间调查，发现水稻白叶枯病疑似症状的，取叶片样送实验室检验。6.2种子检验取样对种子，采取对角线五点或随机取样送实验室检验。7检验方法7.1症状识别发现叶片上有与水稻细菌性条斑病田间症状特征相同或疑似的，可通过症状进行初步判断。水稻白叶枯病田间症状识别见附录B。7.2细菌溢检查将田间采回的样本，切取植株病健交界处组织约20mm2，放在载玻片的水滴中，盖上盖玻片，在低倍显微镜下检查，有无云雾状菌液自叶脉中涌出。7.3噬菌体检验取种子样本10g脱壳，置于无菌的研钵中，加灭菌水20mL浸泡研磨。或取叶片3g剪碎置于无菌的烧杯中，加灭菌水20mL浸泡搅拌。30min后，取上层清液1mL加入无菌培养皿中，再加入1mL浓度为1x109cfu的白叶枯病菌纯培养液，混匀，经3min～5min后，再加入10mL已溶化并冷却至45℃～50℃的肉汁冻培养基，摇匀静置。设三次重复。置于25℃～28℃的温箱中，培养10h～12h后，观察噬菌斑有无。7.4间接ELISA检验法按附录A中规定的检测方法进行。8结果判断8.1症状判定叶片症状符合附录A的特征，且细菌菌溢检查有菌溢，判定样品为水稻白叶枯病。8.2噬菌体检验噬菌体检验结果发现有噬菌斑，判定样品为带水稻白叶枯病菌8.3ELISA8.3.1目测观察DB51/T921—20093在阴性对照不显色，且阳性对照显黄色的前提下，样品反应孔黄色则判定为阳性，即样品带水稻白叶枯病菌；样品反应孔无颜色变化则判定为阴性，即样品不带水稻白叶枯病菌。8.3.2用酶联检测仪测定光密度值在阴性对照孔的光密度值≤0.1时，样品反应孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍，判定为阳性反应，即样品带水稻白叶枯病菌；否则判定为阴性，即样品不带水稻白叶枯病菌。9除害处理检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒除害处理；经检疫鉴定后的样品，应在-80℃至-20℃保存三个月，以备复检、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。DB51/T921—20094附录A（规范性附录）水稻白叶枯病间接ELISA检验程序A.1制样A.1.1植株样品将供试样品剪成20mm2小片，装在小烧杯中，按照供试样品质量（g）：间接样品提取缓冲液体积（mL）＝1：10的比例加入间接样品提取缓冲液研磨样品,静置5min，浸出液经10000rpm离心2min，弃上清液备用。A.1.2种子样品取种子20g，用小型粉碎机粉碎10s，使谷壳破裂。将谷壳用25mL样品提取缓冲液研磨浸泡10min，浸出液经10000rpm离心2min，弃上清备用。A.1.3病原菌菌株用接种环挑取一环病原菌菌液，加入1mL样品提取液中混匀悬浮沉淀，经10000rpm离心2min，弃上清液；重复3次。A.2包被A.2.1加样在制备好的样品中每管加入200μL包被液混合均匀，取100μL加入酶联板各反应孔中，每个样品设三次重复。设置阳性对照、水稻健康组织浸泡液和包被缓冲液为阴性对照。A.2.2封闭将酶联板置于37℃的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200μL封闭液，置于密封且可保湿的容器中，25℃恒温孵育30min。A.2.3洗板将反应孔中的液体倒出,用洗涤液加满每个反应孔，静置1min～2min后，将洗涤液倾出，重复洗涤2次。洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上，吸干反应孔中的水分。A.3结合抗体A.3.1加抗体每孔加入100μL用抗体稀释液稀释100倍的抗体，置于保湿容器中，25℃孵育1h。A.3.2洗板在每个反应孔加入洗涤液，倒出，再加入洗涤液，静置3min后将洗涤液倒出。再重复2次。洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上，吸干反应孔中的水分。A.4结合酶标抗体A.4.1加酶标抗体每孔加入100μL按照使用说明书要求稀释的酶标抗体，25℃孵育1h。A.4.2洗板同A.3.2。A.5显色每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育60min,至阳性对照显色。DB51/T921—20095A.6终止反应显色后在每孔中加入50μL终止液。目测或用酶标仪读取OD值。DB51/T921—20096附录B（资料性附录）水稻白叶枯病田间典型症状B.1水稻白叶枯田间典型症状B.1.1普通型即典型的叶枯型症状。一般在分蘖期后才较明显。发病多从叶尖或叶缘开始，初现黄绿色或暗绿色斑点，后沿叶脉从叶缘或中脉迅速加长扩展成条斑，可达叶片基部和整个叶片，病健交界线明显，成波纹状或直线状。病斑黄色或略带红色，最后变为灰白色或黄白色，病部易见蜜黄色珠状菌脓。B.1.2急性型主要在环境条件适宜品种感病的情况下发生。叶片病斑暗绿色，扩展迅速，几天内可使全叶呈青灰色或灰绿色，最后变为灰白色，呈开水烫伤状，随即纵卷青枯，病部有蜜黄色珠状菌脓。B.1.3凋萎型多在秧田后期至拔节期发生。病株心叶或心叶下1-2叶先呈现失水、青卷、尔后枯萎的症状，随后其他叶片相继青枯。B.1.4叶黄型病株的较老叶片颜色正常，新出叶则呈均匀褪绿或黄色或黄绿色宽条斑，以后病株生长受到抑制。B.2水稻白叶枯病与水稻细菌性条斑病症状比较水稻白叶枯病水稻细菌性条斑病发病部位从叶尖或叶缘开始叶面任何部位病斑形状初为暗绿色短线状，后发展成黄绿色长条纹状，后为灰白色条斑，病、健组织界线明显，分界处成波纹状。初为暗绿色针头状油点，后扩展成由黄绿色到黄褐色，受叶脉限制形成细条病斑。对光透视病斑不透明半透明菌脓田间湿度大时，产生菌脓。蜜黄色、珠状