宏基因组测序简介(发布版)

宏基因组测序2概要宏基因组测序简介宏基因组学发展如何完成一次mNGS难点与挑战34“内因+外需”双轮驱动NGS需求内因：感染性疾病的新发和再发对临床诊断的准确性和实效性提出更高要求。外需：“限抗令”推动NGS在该行业发展。5为什么进行宏基因组测序？很多病原体培养困难。用电镜观察病原体，其灵敏性相对较低。血清学反应，高效的特异性抗体很难获得，有的出现交叉反应而影响结果。PCR法必须基于已知的基因序列，对于未知序列的病原体和变异性大的病原体此法难以实施。四大瓶颈6现有病原体检测技术[1]技术分类优势劣势时间开展检测的医院已知特定病原微生物验证抗原抗体[2-3]•通量大；•检测急性或以前的感染；•低成本•低灵敏性和特异性；•对于细菌，相近的抗原易发生交叉反应。1~3小时大型三甲PCR[2,4]•快速；•高灵敏度；•准确。•检测特定感染；•成本高于培养的方法；•受扩增偏差影响；•无法区分活细胞/死细胞。1~2小时大型三甲（新冠前）芯片[10-11]•中通量•结果稳定性、平行性差4~8小时几乎未开展未知病原微生物检测涂片/培养[5-6]•金标准•低成本•准确率、可靠性依赖于技术经验；•耗时耗力；•敏感性会受到抗感染药物影响；•难培养的病原不能鉴定。通常2~3天，多则一周确认二级、三级医院质谱(MALDI-TOFMS)[2,4]•高通量；•高特异性；•低人工成本；•省时。•基于培养、数据库有待完善；•区分近源物种困难；•高投资和维护费用。几秒到几分钟（培养后）极个别顶尖三甲mNGS[7-9]•高通量；•不依赖培养；•无偏倚检测；•可发现新病原体；•抗生素/抗病毒预测；•功能预测分析。•报告解读困难；•高成本；•操作复杂；•污染问题；•难以区分活/死细胞。1~2天（Nanopore可将时间缩短至几小时）几乎未开展7宏基因组测序是什么？定义：宏基因组测序（MetaGenomicsNextGenerationSequencing，mNGS），最早由威斯康辛大学植物病理学部门的JoHandelsman等于1998年提出，后被伯克利分校的研究人员KevinChen和LiorPachter等定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株”[12]。优势：1、无偏倚，如一个标本中既有曲霉菌又有白色念球菌，培养时，如果白色念球菌生长较快，便会影响曲霉菌的生长，所以培养是有偏倚的，但理论上，宏基因组测序对病原学诊断是没有偏倚的。2、广覆盖，可以同时检测多种病原（如细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体、分枝杆菌等）。3、无需先证知识，mNGS可以无需提前知道该样本中的感染病原。[13]Fields,S.(2001).ProteomicsinGenomeland.Science,291(5507),1221–1224.89宏基因组学发展简史[1]10临床宏基因组学发展现状[1]2019年前108篇临床mNGS研究现状：A.mNGS在疾病诊断中的应用：•中枢神经系统；•呼吸系统；•消化系统；•骨骼肌系统；•视觉系统；•血液循环系统；•肝胆系统；•泌尿系统；•皮肤；•其他。B.临床宏基因组研究的增长情况：C.mNGS研究在不同国家的分布情况；D.mNGS使用的技术平台分布；E.mNGS在不同感染疾病诊断中的应用分布。11最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]12临床宏基因组应用先锋2008年——死后查因[16]3个病人在同一天接受同一个捐献者的器官移植。在移植后4~6周均出现发热后去世。培养、PCR、血清学筛查、芯片检测均为发现有用信息。病人1（肾移植）：取脑组织、脑脊液、血清、肾脏、肝脏样本测序；病人2（肝移植）：取脑脊液和血清样本测序（454）。通过测序鉴定了一个新的沙粒病毒，该病毒会通过实体器官移植传播。2014年——首例临床，免死诊断[17]14岁联合免疫缺陷症男孩；休假回来后，脑膜炎发作；6周内做了38项检测，均为阴性；5种高档抗生素用药，均为康复；脑脊液mNGS，48小时出结果（MiSeq）；检测到475/10196620条reads，钩端螺旋体；上青霉素，32天后康复出院。2019年——病前预测[18]75%13新冠病毒的发现2019年12月26日——坊间发现2019年12月30日——官方发现[19]mNGS发现几十条SARS冠状病毒序列，且仅有这一个有意义的病原体；进一步分析，与BatSARSlikecoronavirus有87%相似，与SARS有81%相似。补测数据，得到几乎完整基因组。武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。Illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。20,000个病毒测序片段。与beta冠状病毒属B分支的基因组相匹配。与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，G772933.1）的全基因组一致性超过85％。14mNGS走向临床——共识与指南[20-23]2016年，FDA发布NGS用于感染疾病监测指南：微生物鉴定、抗菌药物耐药性、独立标志物[20]2018年4月，高通量测序技术写入中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[21]2019年2020年1516宏基因组测序检测流程样本采集样本处理NGS测序数据分析报告解读质控！《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》17样本采集与运输选择直接的感染部位标本，尽量抗生素使用前，病症明显时进行无菌采集。•脑脊液/BAL：选择第2管进行NGS检测；•痰液：生理盐水漱口2-3次以上，咳取深部痰液；气管插管或切开时，吸取深部痰；•组织样本：采样后直接放入无菌管冻存；•血标本：尽量在患者寒战开始时，发热高峰前30-60min取样。低温运输18样本处理样本类型血浆脑脊液肺泡灌洗液全血痰液胸腹水组织人源背景细胞中位数~2.3×105~3×104~1×105~7×106~1.5×107~5×107~107~108样本要求量1ml以上5ml以上5ml/3ml1ml以上1ml以上100mg以上检出限•细菌检出限：10~1000copies/ml；•真菌检出限：10~1000copies/ml；•病毒检出限：1000copies/ml；•支原体/衣原体检出限：100~1000copies/ml；•寄生虫检出限：10~100copies/ml病原核酸富集：DnaseI，2-~650倍[24]；RNA探针+RnaseH，2~724倍[25]；抗体或CRISPER捕获，2~60倍[26]。19文库构建阳对：检出准确性；阴对：实验室背景。20测序数据分析——生信的重要性数据库！21测序数据分析——数据量要求样本类型脑脊液肺泡灌洗液血浆痰液胸腹水建议测序数据量20M40M50M80M100M数据量不够的宏基因组是假的宏基因组！20M平均测序数据量，mNGS敏感性31%[27]；24M平均测序数据量，mNGS敏感性48%[28]；33M平均测序数据量，mNGS敏感性71%[29]；100M平均测序数据量，mNGS敏感性80~90%；数据量/M22报告解读[23]原则：•剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息；•剔除比对流程中交叉引入的假阳性病原体信息；•报告病原体信息原则上准确到种，），同时也应包含相应的属信息；•建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的病原体信息优先呈现；•时将某些部位（如呼吸道、皮肤、肠道等）的常见、低（或无）致病性病原体（定植菌等）独立呈现。阴性结果：•阈值误判？真阴性？•RNA病毒的漏检？（DNA测序）；•阴性判定：mNGS/mtNGS均阴性，内参已知最小病毒＜10copies/ml。阳性结果：•假阳性？•阳性：非体内正常定植菌的外来侵入性微生物在非感染部位出现；病原病毒细菌真菌寄生虫罕见病原阈值3/100万；1000/100万（与宿主高相似度）1/100万（胞内感染菌）5/100万10/100万结合临床进一步确认报告中需注意取样和样本处理过程中引入的污染。23仪器设备试剂准备区标本准备区文库制备区文库扩增与检测区测序区生物安全柜√√√移液器√√√√√超纯水仪（18.2兆欧）√紫外灯√√√√冰箱√√√√√离心机和涡旋仪√√√√√天平/电子秤√金属浴/水浴锅√√磁力架√√√超声打断仪√Qubit核酸定量仪√√√qPCR仪（定量）√凝胶电泳及成像系统√真空浓缩仪（如不需探针法富集病原核酸，则不需配置）√PCR仪√√测序仪（如果进行mNGS，建议配置NextSeq通量的测序仪，其他病原应用，可配置MiSeq通量级别的测序仪。）√不间断电源（UPS）√片段分析仪（agilent、Qseq、PElabchip三个品牌选其一）√服务器（分析量较大时需单独配置机房，配置大型服务器）√宏基因组测序所需的设备2425正视mNGS在感染性疾病诊断中的偏好性[30]样本收集方法没有冷链或核酸稳定剂的样本收集可能会导致核酸降解和假阴性结果或一些生物体的过度生长，导致对丰度的误解。多次冻融也会导致核酸降解。核酸提取方法没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降低检测低丰度水平物种的能力。测序文库制备Poly-A尾部富集RNA将不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。测序方法深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污染。处理对照阴性对照可以识别一些受污染的物种。内部阳性对照可减少实验变异性带来的偏差，提高对低水平物种的识别。分析方法小型精选数据库或高度严格的标准可能不包括新的或意想不到的物种，从而导致假阴性结果。未经整理的数据库或宽松的标准也可能不正确的识别物种。26临床宏基因组应用的局限和挑战[23,31]应用场景有限：成本高，目前mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳入常规临床检测。普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。流程标准化：缺少统一标准。检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。结果数据复杂。污染：宿主核酸、污染物核酸。耗时：测序流程耗时过长。27参考文献[1]Han,D.,Li,Z.,Li,R.,Tan,P.,Zhang,R.,&Li,J.(2019).mNGSinclinicalmicrobiologylaboratories:ontheroadtomaturity.CriticalReviewsinMicrobiology,1–18.[2]CaliendoAM,GilbertDN,GinocchioCC,HansonKE,MayL,QuinnTC,TenoverFC,AllandD,BlaschkeAJ,BonomoRA,etal.2013.Bettertests,bettercare:improveddiagnosticsforinfectiousdiseases.ClinInfectDis.57(suppl3):S139–S170.[3]YeR,ZhuC,SongY,LuQ,GeX,YangX,ZhuMJ,DuD,LiH,LinY.2016.Bioinspiredsynthesisofall-in-oneorganicinorganichybridnanoflowerscombinedwithahandheldpHmeterforon-sitedetectionoffoodpathogen.Small.12(23):3094–3100.[4]SibleyCD,PeiranoG,ChurchDL.2012.Molecularmethodsforpathogenandmicrobialcommunitydetectionandch