介质阻挡放电对人淋巴细胞的作用研究

-1-’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China2.StateKeyLabofElectricalInsulationandPowerEquipment,Xi’anJiaotongUniversity,3.SecondAffiliatedHospitalofMedicalSchoolofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710004,China;#Email:[e-mail]odlymphocytes(PBLC)isolatedfrom20healthyadultvolunteers’bloodsamplesweretreatedwithlow-temperatureplasmainducedbydielectricbarrierdischarge,inordertoinvestigatetheeffectofplasmaonPBLC.ThreeexperimentalgroupsofPBLCtreatedwithplasmawereclassifiedaccordingtotheirlocationslaidonthebottomelectrode,i.e.,theelectrodecenter,theelectrodeedge(2.5cmawayfromelectrodecenter)andtheelectrodeoutside(onaplatformwiththesameheighttobottomelectrodeand5.0cmawayfromelectrodecenter)group,andonecontrolgroupwaswithoutplasmatreatment.Threedifferenttreatmenttimeintervalsweresetas5,15or30s,respectively.Basedonthestatisticalanalysisofexperimentalresults,itisrevealedthat,whilethelymphocytesweremorethan5cmawayfromelectrodecenterorthetreatmenttimewaslessthan5s,theirfunctiondidnotchangesignificantly.Otherwise,thelargerthedosageofemployedplasmaalongwithlongertreatmenttimewas;themoresignificantlyitsfunctionreduced.Furthermore,thelymphocytesapoptosisandnecrosiscausedbyLow-temperatureplasmamayberesultinthedegradationoflymphocytesfunction.Keywords:DielectricBarrierDischarge(DBD);Low-temperaturePlasma;Apoptosis介质阻挡放电对人淋巴细胞的作用研究*石兴民1#,张冠军2,吴喜利3,常正实2，董卓元2，廖文龙21.西安交通大学公共卫生学院,陕西西安7100612.西安交通大学电力设备电气绝缘国家重点实验室,陕西西安7100493.西安交通大学第二附属医院,陕西西安710004摘要：为了探索低温等离子体对人淋巴细胞的影响，应用介质阻挡放电方法产生低温等离子体，对离体的健康成人(n=20)外周血淋巴细胞进行处理。按照淋巴细胞在下电极的位置，实验设电极中心组、电极边缘组（距离电极中心2.5cm）、电极外周组（距离电极中心5cm）3个等离子体处理组和1个不处理的正常对照组，设5s、15s和30s3个处理时间。结果发现当淋巴细胞距离电极中心5cm或处理时间5s时，其功能不会受到影响，而当淋巴细胞距离电极中心5cm或处理时间5s时，等离子体剂量越大，处理的时间越长，淋巴细胞的功能下降的程度越大。进一步研究发现低温等离子体引起淋巴细胞凋亡和坏死可能是其导致淋巴细胞功能下降的原因。关键词：介质阻挡放电（DBD）；低温等离子体；凋亡引言在电工领域，利用气体放电可在大气压下方便快捷地产生低温等离子体[1]。目前，低温等离子体作为一种新的物理消毒灭菌方法已用于医疗器械、食品以及室内空气的消毒灭菌，消毒灭菌效果良好[2-4]。近年*基金资助：受国家杰出青年科学基金（51125029）、陕西省科技计划项目（2010K16-04）及中央高校基本科研业务费专项资金（xjj2012132andxjj20100160）资助-2-来，低温等离子体开始用于人局部组织的创伤修复过程，结果发现其不会引起炎症，有助于损伤组织的修复[5,6]。然而，由于等离子体是由各种粒子（电子、离子、原子、分子）、活性自由基、紫外线、臭氧等组成的混合物[7]，其在用于创伤组织的修复过程和消毒灭菌过程中，是否引起人免疫功能的改变，目前尚未见报道。淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，具有保护机体免受外来微生物的侵袭、维持内环境的稳定以及监视突变细胞的作用。故本研究应用介质阻挡放电(DBD)方法产生低温等离子体，选择人外周血淋巴细胞（PBLC）作为研究对象，探讨低温等离子体对淋巴细胞的作用。1实验方法1.1低温等离子体的产生图1为试验装置示意图，电源采用正弦工频电源，实验中电源电压设定为10kV。放电在两个不锈钢平板电极间发生，电极直径为10cm，电极上覆盖着1mm厚的环氧作为阻挡介质，实验中放电间距取为3mm。无感电阻R（3.9Ω）和电容C（0.47μF）分别用于测量放电电流和放电电量，放电电压由高压探头获取。电压波形和电流波形由示波器泰克DPO3034获得，图2为VP为10kV时外加电压及放电电流的波形。2RCOSC311C1HV1不锈钢电极2阻挡介质3高压探头图1试验装置示意图图图2VP=10kV时外加电压及放电电流波形1.2PBLC的分离PBLC来自20例身体健康的成人志愿者，男10例，女10例，年龄30岁±6岁。取志愿者外周静脉血5mL肝素抗凝，用淋巴细胞分离液密度梯度1.077常规分离[8]，用D-Hank＇s液将PBLC浓度调至1×108个/mL.1.3低温等离子体对PBLC的处理试验在常气压下的超净工作台中进行，在室温20℃，相对湿度60%的环境条件下，将细胞悬液滴在灭菌后的盖玻片上（2cm×2cm），每人的淋巴细胞悬液分别涂12个盖玻片，每片30ul。然后将盖玻片置于等离子体发生装置的下电极上，外加电压进行处理，处理时间分别为5s、15s、30s，每一时间段同时放4个盖玻片（同一个人的PBLC），一片不处理作为对照，一片置于电极中央，一片置于电极边缘，一片放于电极外周的平台上（与下电极相同高度），三个被等离子体处理的盖玻片中心间距都为2.5cm。即实验设1个对照组和三个实验组—电极中央组、电极边缘组、电极外周组。1.4淋巴细胞功能的检测每一处理后立即用100ul加有20%小牛血清的1640细胞培养液将细胞悬液冲入96孔细胞培养板中，每个样本片一孔，注意无菌操作及将细胞悬液完全冲入孔中；然后采用MTT比色法测定淋巴细胞的功能[9]。-3-最后，酶标仪检测各孔光密度（OD）值（检测波长560nm）。记录结果，计算刺激指数（SI），刺激指数的计算公式为：SI=ConA刺激管OD均值/对照管OD均值。1.5显微镜观察取电极中央组、电极边缘组、电极外周组各一个被等离子体处理30s后的样本，调整细胞浓度为106个/mL,取9滴细胞悬液移入Eppendorf管中，加1滴0.4%台盼兰溶液染色，3min后取样在光学显微镜下放大400倍观察和拍照。同时观察正常对照片，进行比较分析。台盼兰为带电荷的染料，胞膜完整的活细胞对其拒染，故台盼兰使死细胞着色，活细胞不着色[10]。1.6淋巴细胞凋亡的检测用3mLPBS将等离子体处理30s后的淋巴细胞悬液冲入离心管内，1000r/min离心10min，收集细胞并洗涤3次；然后按照凋亡检测试剂盒说明操作，简单的讲，用250uL结合缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为106个/mL；取100uL细胞悬液于5mL流式管中，加入5uLAnnexin-V和10uL的PI溶液，室温避光染色15min；向流式管中加入400uLPBS，最后用流式细胞仪测量。1.7统计分析实验重复5次，实验数据以x±SD（均数±标准差）形式表示，均数间的差异采用随机区组方差分析方法检验，应用SPSS13.0统计软件分析。2结果2.1距离电极中心的距离和处理时间对淋巴细胞的功能的影响与电极中心的间距对淋巴细胞功能的影响见表1。等离子体处理5s后，三个实验组与对照组之间SI值（反映淋巴细胞功能）接近，差异都无统计学意义（P0.05），三个实验组之间SI值差异也无统计学意义（P0.05）。等离子体分别处理15s和30s后，电极外周组与对照组相比，SI值差异无统计学意义（P0.05）,而电极中心组和电极边缘组与对照组相比，SI值明显降低，差异有统计学意义（P0.05），三个处理组之间两两比较，SI值差异有统计学意义（P0.05），淋巴细胞功能由高到低都依次为电极外周组，电极边缘组和电极中心组。也即当淋巴细胞距离电极中心的距离5cm时，淋巴细胞的功能不会受到影响，当淋巴细胞距离电极中心的距离5cm时，淋巴细胞的功能下降，越靠近电极中心，下降的程度越大。从表1中也可发现处理时间对PBLC功能的影响，对照组在三个处理时间SI值没有变化，电极外周组在三个处理时间SI值也基本没有变化（P0.05）。电极中心组和电极边缘组随着处理时间（5s、15s、30s）的延长，SI值呈下降趋势，三个作用时间之间两两比较，SI值差异有统计学意义（P0.05），淋巴细胞功能由高到低依次为5s、15s、30s。也即当处理时间5s时，淋巴细胞的功能不会受到影响，当处理时间5s时,淋巴细胞的功能下降，处理的时间越长，下降的程度越大。表1等离子体对PBLC功能的影响（以SI值表示，n=20）组别处理时间(s)51530对照组1.12±0.261.12±0.251.12±0.26中心组1.12±0.240.71±0.10*0.58±0.15*边缘组1.10±0.280.82±0.23*0.63±0.11*外周组1.10±0.381.10±0.321.10±0.35*P0.05vs对照组2.2光镜观察结果图3（a）显示，未处理的淋巴细胞透明无色，表明细胞膜完整，对台盼兰拒染，为活细胞。图3（b）-4-显示电极中心组处理30s后的人淋巴细胞大多数被台盼兰染成蓝黑色，表明大多数细胞膜已破坏，细胞已死亡。图3（c）显示电极边缘组处理30s后的人淋巴细胞一部分透明无色，有一部分颜色淡蓝色，表明这些细胞接近死亡，一部分颜色很深即蓝黑色，表明细胞已死亡。图3（d）显示电极外周组处理30s后的人淋巴细胞透明无色，与图3（a）接近，为活细胞。(a)正常对照组(b)电极中心组(c)电极边缘组(d)电极外围组图3淋巴细胞的光镜观察结果（×400）2.3淋巴细胞凋亡的检测结果图4为淋巴细胞凋亡的检测结果，Annexin-V