实验5-原位杂交-2

核酸分子杂交技术实验对象：海蜇胚胎-横裂体和碟状体杂交技术的原理杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程，称为杂交。杂交的三种形式：DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA，其稳定性依次增大。检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位的核酸。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性。主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定位、定性、定量检测、特定基因的时空表达模式和疾病的诊断等方面。1、模板的制备方法一、制备质粒模板方法二、PCR法：在引物中引入启动子序列，聚合酶选用高保真、末端不加A的酶。目的片段克隆到载体(pGEM-pEasy)将PCR产物与pEasy-T3连接，连接是非定向的，需要测序确定连接的方式。体外转录法合成RNA探针A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留）B、酶切（酶切位点的选择原则）：使合成的探针长度在200bp-1000bp；尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。C、酶切产物的回收胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC处理的水，切勿混入超过0.1M的EDTA）。体外转录法合成RNA探针体外转录合成反义探针的模板（原位杂交所用的探针）是DNA的编码链体外转录合成正义探针（原位杂交中的阴性对照）的模板是DNA的模板链5’ATGTAATACATT5’3’3’3’5’5’3’TTACATAATGTA5’3’3’3’5’5’5’3’ATGTAATACATTAB如果插入方向如图A，则反义探针的合成，应用限制性内切酶在靠近T7启动子的位置将质粒线性化，然后用SP6RNA聚合酶来合成探针T7Sp6T7Sp6如果插入方向如图B，则反义探针的合成，应用限制性内切酶在靠近SP6启动子的位置将质粒线性化，然后用T7RNA聚合酶来合成探针2、体外转录混匀后37℃2.5小时加2ulDNase1(RNase-free)，37℃20分钟，消化DNA模板加入1ulEDTA（pH8.0）终止反应。体外转录法合成RNA探针试剂及材料体积（20ul）溶于DEPC处理水中的线性化质粒1ugin10ul水中含DIG标记的NTPMix1ul转录缓冲液（10×）1ulRNA聚合酶（SP6、T7或T3）1ul(20U/μl)RNA酶抑制剂1ul配制新鲜电泳缓冲液TAE和琼脂糖胶，以降低RNA的降解速度。点DNAmarker估计其分子量。体外转录法合成RNA探针3、探针检测体外转录法合成RNA探针5、探针效率测定A、将探针稀释成不同的浓度，点1μl于尼龙膜上，80度烘膜3h（或120度烘烤30min），固定探针；B、Washingbuffer洗膜2min；C、Blockingsolution封闭30min；D、Antibodysolution抗体30min；E、Detectionbuffer孵育5min；F、NBT/BCIP显色。体外转录法合成RNA探针体外转录法合成RNA探针探针制备中的关键问题1、RNasefree2、酶切位点的选择3、质粒模板的质量体外转录法合成RNA探针1、胚胎的固定和水化4%PFA固定胚胎，酒精梯度脱水后保存于-20度。将保存于无水乙醇的胚胎经90%乙醇-70%乙醇-50%乙醇-30%乙醇-DEPC处理的水-PBS梯度水化。胚胎原位杂交实验步骤2、预杂交杂交液：50%甲酰胺，0.1mg/ml肝素，1×SSC，1×Denhart’s，0.1%Tween，5mMEDTA，0.25mg/ml酵母tRNA。(1)60°C加热hybridizationbuffer。(2)50%NaPBS+50%杂交液与胚胎作用，15min。(3)除去hybridizationbuffer，将预热的不含探针的杂交液与胚胎作用，60°C，3小时。3、杂交将探针加入杂交液中，并作用于胚胎。杂交条件：60度，12－20hr。4、杂交后洗脱（温度和盐浓度）杂交液60°C15minWash15×SSC50%甲酰胺0.5%SDS0.05%Tween-2060°C20min×2Wash22×SSC50%甲酰胺0.4%SDS0.05%Tween-2060°C20min×2Wash32×SSC0.1%Tween-2060°C20min×2Wash40.2×SSC0.1%Tween-2060°C20min×26.抗DIG抗体孵育Antibodysolution（1：1000稀释）0.5ml/管4°C过夜。提供1：200抗体，请同学们自己稀释到1：1000（200ul抗体+800ul5%goatserum）PBS洗涤（1ml/管）1次每次6分钟（min）5.封闭：换掉PBS，用5%goatserum进行封闭孵育0.5ml/管室温1小时（h）7.洗涤：（1）弃除抗体，用PBS洗涤胚胎，4次，每次6min；（2）TMNTbuffer浸洗胚胎10min500ul/管8.显色用NBT/BCIP显色液显色，室温，500ul/管放入暗处（用锡箔纸包住），20分钟镜检观察信号。9.染色的终止：胚胎出现明显兰紫色染色时，去除NBT/BCIP显色液用甲醇或PBS终止显色，进行拍照记录。