植物体内游离脯氨酸含量的测定

植物体内游离脯氨酸含量的测定目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。（二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。2.仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。3.试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮2.5g放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。现用现配。（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸0.0100g溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。（三）操作步骤1.标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg·mL-1。（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品提取：称取鲜样0.5～1.0g，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。3.样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。（四）结果计算WVCA式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；V为样品稀释体积（mL）；W为样品重量（g）。【附注】脯氨酸与茚三酮于100℃下的反应时间需严格控制，不宜过久，否则将产生沉淀。二、磺基水杨酸法（一）原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。（二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：待测植物（水稻小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。2.仪器：分光光度计、冰浴锅、研钵、小烧杯、容量瓶、具塞刻度试管、普通试管、移液管、注射器、漏斗、滤纸、剪刀等。3.试剂：（1）酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL6mol·L-1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。（2）3％磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。（3）其他试剂：冰醋酸、甲苯。（三）操作步骤1．标准曲线的制作（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液浓度为100μg·mL-1。（2）取6个50mL容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为l、2、3、4、5、6μg·mL-1。（3）取6支具塞刻度试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。2．样品的测定（1）准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置于具塞刻度试管中，然后向各管分别加入5mL3％磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2mL提取液于另一干净的具塞刻度试管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4mL甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10mL离心管中，以3000rpm离心5min。（4）用注射器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，记录吸光度值。（四）结果计算1001056WCA式中：A为样品脯氨酸含量（％）；C为测定液中脯氨酸浓度（μg·mL-1）；5为3％磺基水杨酸的量（mL）；W为样品鲜重（g）。