湖南师范大学“国家大学生创新性实验计划”项目申请表

湖南师范大学“国家大学生创新性实验计划”项目申请表2007年二学期项目名称豆芽生产中的蛋白转化效率及提高蛋白营养的方法研究个人申请□团队申请□√团队名称豆芽研究小组申请经费10000元起止时间2007年11月至2008年11月申请人或团队姓名张亦雅吴芳唐聃李晶肖瑛年级2005级2005级2005级2005级2005级专业生物科学生物科学生物基地生物科学生物科学联系人张亦雅所在院、专业生命科学学院生物科学专业联系电话[e-mail]导师姜孝成职务/职称教授联系电话[e-mail]计划时数600建议学分6学分主体设备培养箱、分光光度计、电泳仪、离心机、微量凯氏定氮器消耗材料经费预算种类5种豆类种子培养液配置所需物质测定时所需试剂培养槽等用具用量300~500斤若干若干若干经费（元）2000200050001000总计（元）10000申请理由（包括自身具备的知识条件：自己的特长、兴趣等）1.豆芽的优势：豆类经萌发生成豆芽后，各种有害因子亦可大部分被去除，而且豆芽中的蛋白质利用率比豆类蛋白质利用率提高5～10%；所含不易消化的多糖物质，在发芽过程中急剧下降以至消失，避免了吃豆类腹胀和过敏等现象。豆芽在发芽过程中由于酶的作用，使更多的矿物质被释放出来，易于被人体利用，同时维生素C、B2、烟酸及胡萝卜素均成倍地增加，所以豆芽菜是可与绿叶菜相媲美的佳蔬。同时，豆类中的还原性维生素C含量大大增加，可促进钙的吸收和利用[1]。2.豆类蛋白在健康方面的价值：大量临床试验证明：豆类蛋白有降低胆固醇的作用及心血管疾病的其他生物指标的作用，如豆类蛋白可降低血液中的胆固醇水平，并且在心脏病的预防也有有效作用。豆类蛋白还对其他慢性疾病有作用，如豆类蛋白对减少某些癌症(乳腺癌，前列腺癌和结肠癌)患病风险肿瘤；异黄酮对人体有独特的抗氧化作用，食用含有异黄酮的豆类蛋白质能对骨矿物质密度有积极作用，能有效降低骨质疏松症发病率还能明显减轻肌肉酸痛，消除肌肉炎症，缓解肌肉疲劳，加速肌肉复原；同时某些豆类蛋白能促进糖素的分泌，加速利用内储存的脂肪来提供能量，达到控制体重的目的，同时它又具有较低的血糖指数(GI)，不会引起血糖的大幅度上升，富含蛋白质的食物可以带来饱食感，从而帮助减少食欲和食物摄入量等等[2]。3.据统计豆类中的蛋白质含量非常丰富，可比谷物中蛋白多两倍，赖氨酸含量也比谷物中的多一倍以上。但豆芽中的蛋白含量及其生产过程中豆类种子的蛋白转化至豆芽中的蛋白的效率研究甚少。生产者往往缺乏先进的科学知识，过分注重其经济效益而忽略其营养价值，特别是从未考虑过如何增加豆芽中的蛋白含量。随着人们的健康意识日益增强，对健康绿色食品的需求日益强烈,市场上陆续出现蚕豆芽，花生芽和黑豆芽等。然而，现有对豆类蛋白的研究还不够详细，至今所得的数据都是总的蛋白含量，如黄豆中含蛋白114g/公斤，绿豆中含31g/公斤，蚕豆中130g/公斤。因此，我们试图研究多种豆类来源的豆芽的蛋白含量，以及其生产过程中多种蛋白质的转化效率，而且尝试改进培育方法，以增加豆芽中的蛋白含量，提高其产品质量。4.兴趣是最好的老师，我们5名组员对植物有着浓厚的兴趣，平时试验时认真细心，善于思考，有一定的动手能力和创造能力。尤其在暑假期间，有组员跟随老师到邵阳各地进行野外种子采集，对种子有深入的了解，知识视野也大大扩展。同学之间相互团结合作，有利于试验的顺利开展。参考文献：[1]姚继霞，生活百科，保健食品黄豆芽；叶自新，豆芽生产技术，金盾出版社，2~4；[2]姚继霞，抗癌保健食品——黄豆芽，饮食药膳；大豆蛋白对人体健康的新探索，中外食品，2004年第6期。[3]梁鸿秋、安静、吴显荣，食用豆类种子蛋白研究初报，作物学报，第14卷第2期。项目创新点及方案设计项目创新点：一、选择豆芽的原因：1.豆芽具有普遍性，容易获得原料。2.在豆类的豆芽发育过程研究中，选择多种材料进行研究比较，如绿豆，黄豆，花生，蚕豆，黑豆等，便于选取营养价值较高的品种。3.具体研究以上几种豆芽生长过程中多种蛋白的含量变化，以确定何时其营养价值最高。4．豆芽的生长周期短，便于全程跟踪及反复试验。二、随着时代的发展，人们对于营养与健康等诸多方面的细节也更为关注，我们的课题恰好迎合人们日益增长的这一意识，有较好的发展前景。三、尝试改变豆芽的培育方法——运用含有特殊物质的培养液或将豆类种子进行特殊处理后培育。设计方案：一、测定豆类种子和豆芽中蛋白质的总含量：——微量凯氏定氮法。试验试剂：浓H2SO4(C·P·或A·R)；1％硼酸；0.01NHCL；10％CuSO4；无水硫酸钠(或无水硫酸钾)；50%（W/W）NaOH溶液：50gNaOH溶于50ml蒸馏水中；甲基红——次甲基蓝混合指示剂：将0.2%的甲基红酒精溶液与0.1%次甲蓝的水溶液等量混合即成；0.1M的硫酸铵试验仪器：凯氏烧瓶(100m1)；小漏斗及消化架；电炉(或酒精灯)；微量凯氏定氮器；容量瓶(100m1)；锥形瓶(50m1)；量筒(10m1)；容量吸管(5，10m1)；滴定管；玻璃珠操作步骤：（1）样品称量：称取均匀样品200mg放入100ml凯氏烧瓶内。同时，做一空白对照和回收（0.1M硫酸铵5ml，相当于14mg氮）。（2）消化：a.在凯氏烧瓶内加入粉状无水硫酸钾0.3g（约一小匙），10％硫酸铜溶液2ml及浓硫酸3ml，瓶内放入几粒玻璃珠，瓶口加一小漏斗，置烧瓶于电炉上用铁丝网直接加热。b.先用小火加热，时时转动凯氏烧瓶防止溶液起泡外溅。c.待样品中泡沫消失后即加大火，烧至溶液透明取下待冷。d.稀释：加蒸馏水10ml于烧瓶内，待冷后将样液转入100ml容量瓶中，以蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度混匀备用。（3）蒸馏与滴定（蒸馏装置见图）：a.蒸馏器先用洗涤剂浸泡，清水洗涤，用蒸馏水空蒸一次。b.凯氏蒸馏器的使用程序是：将止水夹P1、P2、P3夹紧，开水笼头（E），使水从E管→F管→G管→K管流出。开放P3使水流到A室（注意水流不能过急，否则会从管口溢出）。c.开放P2从D放少量蒸馏水于B室，夹紧P1，然后堵塞G管口开放P1，将B室蒸馏水吸出。这样可以检查是否漏气，如果漏气水无法吸出，就应马上检验各接头情况。d.吸取硼酸溶液10ml放入锥形瓶内，加入2滴混合指示剂，再把锥形瓶置于M管下，管口浸入硼酸溶液中。e.从漏斗处加入消化稀释液5ml。用蒸馏水少许洗涤，再加50%NaOH5ml，迅速关闭P2，小漏斗里加水密封。f.在A室下用酒精灯加热(加热过程中火焰大小要稳定，否则溶液会从M管吸回)。直至硼酸液从蓝色变为绿色。再继续加热5分钟，将M管离开液面，再蒸馏1分钟，用蒸馏水冲洗管壁，取下锥形瓶。g.蒸馏以后立即清洗蒸馏器，其法是先堵塞G管口，放开P2及P3，将B室的水吸出。然后从D漏斗加入蒸馏水至B室，再将G管塞住，开放P1和P3，如重复2~3次即可。h.以标定过的0.01N的HCL溶液滴定硼酸吸收液至蓝紫色为止，记录用量。空白和回收的操作步骤同样品。计算：一般混合膳食的蛋白质平均含氮量为16%，故从已知含量求蛋白质量时，应乘上系数6.25，不同食品的蛋白质含氮量稍有不同，因此其蛋白质系数也不相同，如乳类的蛋白质系数为6.38，黄豆为5.71，大米为5.95。1NHCLlml相当于14mg氮。蛋白质含量计算公式：a——滴定样品所用标准盐酸的m1数b——滴定空白所用标准盐酸的m1数N——盐酸当量浓度C——蒸馏时吸取稀释消化液m1数W——样品重量(g)回收率公式：a——滴定回收所用标准盐酸的m1数b——滴定空白所用标准盐酸的m1数N——盐酸当量浓度二、豆芽的培养1.豆种的选择：选择颗粒饱满而带光泽的豆粒，最好是当年收获的新豆或仅贮藏“一年的新鲜豆种。从粮站购置的绿豆，一般可用来培育绿豆牙，而从粮站购买的黄豆．一般不宜培育黄豆芽．因为这些黄豆，多半在仓库中贮藏了3—4年，已超出可以发芽的贮藏期限。豆种在培育蛆芽前．要先进行顶选拣去明显的瘪粒、破碎粒祁虫蛀粒等。2．培育前的准备经过预选的豆种，用60摄氏度的热水浸泡1—2分钟．搅并1—2次，加入情洁的白来水或井水．淘洗干净．滤去疙粒、碎粒和虫蛀粒。然后将豆种倒入培育器皿中，加入与豆种同等重量的清水浸种。浸种时间为8一l2小时。但在冬季浸种时，要用20一23摄氏度温水，夏季浸种可直接用冷水。3．立芽的培育方法：当达到浸种时间要求后，豆种充分吸水膨胀，表皮破裂。白色胚根始露，即可将浸种时余下的积水倒干，然后在其上方用清洁的毛巾、纱巾遮盖严密，并将培育器具放在避光、潮湿的地方。在豆芽培育期间，每天早晨、中午、傍晚及夜晚睡觉前各淋水1次。每次淋水时，可先将覆盖的毛巾或纱布揭开．然后向培育的器具内添加清洁的自来水或井水，使水面超过豆芽表面，停留2—3分钟再倒干净，这样反复进行2—3次就可以了。每次淋水后，再盖毛巾或纱布等覆盖物。（如果培等的豆芽数量较多．从培育后的第二大开始，应将豆芽倒入较大的器具(钵或罐)中培育。因为豆芽生长、还会冒出器具的顶面，豆先无后会出现返青现象，或者与空气直接接触后，培育的百芽会根长茎细，品质低劣。）4.豆芽的采收家庭培育的电芽，一般在夏季温度高“只需3—4天时间，豆芽就可成熟；冬季温度低，则需7—8天。为了促进豆芽的牛长，冬季可用温水淋豆种．并将培行豆芋的器具放在灶头、炉旁保温；如果室内有暖气．则更加理想；夏季如果温度过高．可用井水或水桶中预冷的凉水淋豆芽。这样培育的豆芽粗壮，品质脆嫩。如果采收的豆芽，当日未用完，可用干净的冷水泡起来．水面超过豆芽面10厘米左右，但要注意避免光和热。（此外．实验室培育豆芽还可采用连续生豆芽的方法，比一般培育豆芽的供应期长，可分批分期使用，其方法如：取细砂1．5——2千克．竹筐或箩一个．黄豆0．5干克。在竹筐、箩里放一层砂，砂上放一层豆种，再铺上一层薄砂，再放上一层豆种，这样可放好几层。最上面铺盖的是砂，在砂上面盖一些干草(稻、麦草等)，早晚淋水各一次。第一层采收后，仍旧把干草盖在上面。继续浇水．第二天又可取出一层。）三、豆类种子和豆芽中蛋白质的分离与含量测定试验仪器：721分光光度计；量筒；烧杯；容量瓶；移液管；分析天平；试验试剂：标准蛋白质溶液：用球蛋白，清蛋白，醇溶液谷蛋白和谷蛋白配成四份含蛋白质100μg／Ml的标准蛋白溶液;4.7％乙醇；8.5％磷酸(W／V)；考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。1.蛋白质的分离1.)豆类种子和豆芽中总蛋白质的提取：0.5g脱脂豆类种子粉，豆芽洗干净，晾干，烘干取0.5g脱脂豆芽粉，0.05mol/LTris-HCL缓冲液50ml（pH8.0含0.2%SDS和3mol/L脲素），充分搅拌10min，3000到4000r/min离心分离10min，收集上清液，沉淀物用上述方法重复提取3次，合并上清液（总蛋白），待测。项目创新点及方案设计2.)球蛋白和清蛋白的提取。取适量总蛋白提取液，加入其体积1/10且pH4.0的1mol/L乙酸（乙酸钠缓冲溶液），3000到4000r/min离心分离10min，沉淀即为球蛋白，上清液沉淀分离后，向上清液中加入4倍体积的预冷丙酮并置-20度下放置2小时，离心沉淀即为清蛋白，弃去上清液，分别收集沉淀，待测；3.)醇溶液谷蛋白和谷蛋白的提取：醇溶液谷蛋白用70%乙醇+0.05%DDT（二硫苏糖醇）提取。谷蛋白用0.4%NaOH提取。2.各种蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝G－250染色法1.)在试管中加入分别加入0.1ml0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的四种蛋白溶液，再加入5mL的考马斯亮蓝G－250，充分混匀后，于595nm处测定OD值，根据测定结果绘制OD值—蛋白质的浓度曲线，