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乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立欧赛英1,潘杨滨1,陈秀发1,沙利烽1,梁 辰2,冯 杰2,薛 辉2,颜光涛2(1.苏州长光华医生物试剂有限公司,江苏苏州215163;2.中国人民解放军总医院医学检验中心,北京100853)DOI:10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2019.06.037收稿日期:20180830;修回日期:20181210通讯作者:颜光涛,研究员。研究方向:标记免疫分析技术。Email:ygt301@163.com摘要:目的 建立一种定量检测乙肝表面抗原(HBsAg)的化学发光免疫分析方法并评估其性能。方法 利用双抗体夹心法实验原理,用吖啶酯标记多抗,用生物素标记两株单抗,通过磁颗粒链霉亲和素生物素系统分离固相和液相完成检测。结果 本方法的检测限为0.05IU/mL,线性范围为0.05~150IU/mL,可溯源至国际标准品,批内变异小于5%,总变异小于8%,浓度高达106IU/mL的强阳样本未出现HOOK效应;5套阳转盘对雅培Architect、西门子centaur和强生VITROS发光试剂相对敏感系数分别是3、0、-3;国家参考盘检出达标;与雅培Architect比较,2000例临床样本检测灵敏度为99.77%,特异性为100%,一致性达99.95%。结论 本研究建立的HBsAg定量检测试剂,各项指标均满足临床检测的要求,灵敏度高,特异性好,适合临床推广应用。关键词:乙肝表面抗原; 链霉亲和素生物素; 化学发光免疫分析(CLIA); 酶联免疫分析(ELISA)TheEstablishmentofAcridiniumEsterchemiluminescenceImmunoassayMethodfortheQuantitativeDetectionofHepatitisBSurfaceAntigenOUSaiying,PANYangbing,CHENXiufa,SHALifeng,LIANGCheng,FENGJie,XUEHui,YANGuangtao(SuzhouHybiomeBiomedicalEngineering.Co.,LTD,Suzhou215163,China;MedicalLaboratoryCenter,PLAGeneralHospital,Beijing100853,China)Abstract:ObjectiveToestablishaquantitativedetectionmethodforHepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)andevaluateitsperformance.MethodsAccordingtotheprincipleofdoubleantibodysandwich,antiHBsAgpolyclonalantibodywaslinkedwithacridiniumester,andtheothertwostrainsofantiHBsAgmonoclonalantibodywerelinkedwithbiotin,andmagneticbeadswerecoatedbystreptavidin.Thedetectionwascarriedoutviastreptavidinbiotinseparationsystemandwashingprocess.ResultsThelimitofthedetectionwas0.05IU/mL,andthelinearrangewas0.05150IU/mL,alsotheintrabatchandtotalvariationwaslowerthan5%and8%,respectively.NoHOOKeffectwasobservedinstrongpositivesampleswithaconcentrationof106IU/mL.Therelativesensitivitycoefficientsofthe5seroconvertionpanel,comparedwithAbbottArchitect,SiemensCentaurandJohnsonVITROSchemiluminescentreagents,were3,0and3,respectively.Nationalreferenceplatedetectionresultsconformtotherequirements.ComparedwithAbbottArchitectHBsAgkit,thesensitivityandspecificityofthe2000clinicalsampleswere99.77%,100%,respectively,andtheconsistencywas99.95%.ConclusionTheHBsAgquantitativetestreagentestablishedinthisstudymeetstherequirementsoftheclinicalapplication,withhighsensitivityandspecificity,andissuitableforclinicalapplication.Keywords:HepatitisBVirussurfaceantigen(HBsAg); Streptomycinadvinbiotin; Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA); Enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)2501LabeledImmunoassays&ClinMed,Jun.2019,Vol.26,No.6 慢性乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitisBvirusHBV)感染可导致肝硬化和肝细胞癌等严重后果,从而带来巨大的社会经济负担,已成为全球公共卫生问题。根据WHO公布数据,目前,全球60亿人口中约有20亿感染过HBV,其中3.5亿为慢性感染者,每年约有78万人死于HBV相关性肝硬化和肝癌[1]。根据HBV基因组差异性大于8%,HBV被分成10种基因型(A~J)及40种不同的亚基因型,不同基因型HBV流行病学特征不同[2]。HBsAg是HBV感染后首先出现的血清标志物,预示价值高,是目前临床上应用最多的血清标志物,也是WHO公认的判断HBV感染的关键指标。随着检测技术的不断发展,临床检测和血筛市场对灵敏度的要求也越来越高,目前全球有多达上百个相关检测产品,包括酶联免疫法、胶体金标记法、化学发光等分析方法,以化学发光法的灵敏度为最佳[3]。高灵敏度、高特异性、以及定量检测是HBsAg检测的三大趋势。本文根据化学发光免疫定量分析的原理,采用吖碇酯标记分析技术,用双抗体夹心法建立检测人血清/血浆中HBsAg含量的方法,现将试验结果报道如下。材料和方法 1 材料 1.1 试验仪器及主要试剂 吖碇酯和生物素购自Sigma公司;乙肝表面抗原单抗和多抗购自Fitzgerald公司;HBsAg国际校准品(NIBSCcode:12/226)购自NationalInstitueforBiologicalStandardandControl;HBsAg国家参考盘购自中检所;阳转盘购自BBI公司;对照试剂为雅培ArchitectHBsAg定量检测试剂盒。全自动化学发光分析仪由苏州长光华医生物工程有限公司研发生产。 1.2 标本来源 1000例阴性样本:来自医院体检样本,并且Architect检测结果均为阴性。医院日常检验样本:2000例,含250例干扰样本(200例孕妇血、10例类风湿样本、10例ANTIHAV、10例梅毒、10例antiCMV、10例酒精肝),经对照试剂检测过,冷冻于-20°C保存。 2 方法 2.1 操作方法 本方法采用两步法模式(洗涤两次)进行操作。第一步反应:将样本和生物素化乙型肝炎病毒表面抗体(AntiHBs)进行反应,如果标本中含有HBsAg,将形成抗原抗体复合体,加入链霉亲和素包被的微粒,复合体在生物素和链霉亲和素相互作用下形成固相。随后将反应液置于一个磁场内,检测中的磁微粒将被吸附,通过洗涤,将未结合物冲洗除去。第二步:加入吖啶酯标记的AntiHBs,与磁颗粒上的HBsAg复合物反应,通过洗涤,将未结合物冲洗除去。然后,注入化学发光缓冲液1和2,检测其化学发光光子强度;产生的光强度与样本内HBsAg浓度成正比。 2.2 生物素标记抗体的制备 取两株HBsAg单抗按1∶10~1∶20的摩尔比混合,采用0.05mol/LpH9.5CB调整浓度为1mg/mL;按抗体∶生物素=1∶10~1∶20摩尔比边搅拌边混合,室温反应0.5~1.5h;透析纯化至少3次去除多余生物素和小分子,加入等量甘油,放置-20℃保存。 2.3 吖碇酯标记抗体的制备 取一定量HBsAg多抗,采用0.05mol/LpH9.5CB调整浓度为1mg/mL;按抗体:吖啶酯=1∶10~1∶20摩尔比边搅拌边混匀,室温反应0.5~1.5h;透析纯化至少3次去除多余小分子,加入等量甘油,放置-20℃保存。 2.4 发光激发缓冲液1、2的配制 激发液1为0.1mol/LHNO3溶解1%过氧化氢;激发液2为0.1mol/LNaOH。此激发液1、2配制完毕后密封于2~30℃避光保存。 2.5 试剂盒优化 通过基础缓冲液选择、样本加样量选择、抗体稀释度和体积的选择、反应步骤选择、反应时间的选择对体系进行优化。 3 方法学评价 3.1 检测限(limitofdetection,LoD) 参考CLSIEP17A,检测1000例阴性样本(B)的发光值;另外检测5个连续浓度梯度极低浓度样本(S),每天重复4次,连续测5d。根据公式LoD=μB+1.645σB+1.645σs,其中μB表示阴性样本发光平均值,σB表示阴性样本标准差,σs表示低浓度样本标准差,计算出检测限的发光值,将此发光值代入标准曲线,得出的浓度值即检测限。 3.2 剂量反应曲线 参考CLSIEP6A2,将接近线性范围浓度上限的高值样本,稀释6个浓度梯度至接近下限。用最小二乘法将测定结果(3次平均值)和稀释比例进行线性拟合,计算线性相关系数r。3501标记免疫分析与临床 2019年6月第26卷第6期 3.3 标准品的溯源[4] 将第三代国际校准品12/226用1mL纯水复溶。之后用阴性人血浆为基质液配置HBsAg浓度为0、0.05、0.5、1、5、10IU/mL的校准品。混合5份以上高浓度阳性样本,用阴性人血浆梯度稀释。用国际校准品对公司校准品进行赋值。赋值后的公司校准品定标检测国际校准品(2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313IU/mL),观察国际校准品的理论值与测值偏差。 3.4 精密度 采用三批次试剂,对5份样本(其中3份高中低质控品,2份为校准品),每天上下午各检测一次,每次双孔,共进行20d。 3.5 HOOK效应 用本方法对HBsAg浓度高达106IU/mL的样本倍比稀释至150IU/mL,双孔测定并分析发光值与浓度值的关系,判定试剂是否出现HOOK效应。 3.6 国家参考品盘 检测HBsAg国家参考品盘,包括3份阳性参考品,20份阴性参考品及9份灵敏度参考品。 7.7 诊断灵敏度 采用本方法对5套阳转血清盘进行检测,根据检测结果,并参照WHO对阳转血清相对灵敏度系数的计算方法来评估对HBV早期感染的能力进行评价。相对灵敏度系数是评价试剂对窗口期样本检测能力的指标。计算方法为:对每一个阳转盘,将对照试剂检出的第一份系列血清定为0,将待评价试剂检测结果与其做对比,确定待评价试剂检出的第一份系列血清与参比试剂的0血清的位置关系。对任一阳转血清盘而言,若待评价试剂检出的第一份阳性样本在参比试剂0血清前2位,则记为-2;反之,若在参比试剂0位置的后3位,则相对敏感系数为+3。如此类推,对全部阳转
本文标题:乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立
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