课题1微生物的实验室培养

常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.弧菌课题1微生物的实验室培养四川省南部中学：马彦平（一）培养基：1、培养基概念按照微生物对的不同需求，配制出供其的营养基质。营养物质生长繁殖2、培养基的营养构成一般都含有、、和四类营养成分。还需要满足微生物生长对、及等的要求。水碳源氮源无机盐pH特殊营养物质氧气1、碳源无机碳源：有机碳源：CO2、NaCO3等糖类、脂肪酸、花生粉饼等3）功能：a、主要用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物b、有些有机碳源是异养型微生物的主要能源物质2）类型：4）特点：最常用的碳源是糖类，尤其是C6H12O6碳源的需求量最大但不同微生物对碳源的要求差别很大1）定义：凡能为微生物的生长繁殖提供所需碳元素的物质2、氮源1）定义：2）类型：3）功能：4）特点：凡能为微生物的生长繁殖提供所需氮元素的物质无机氮源：有机氮源：N2、NH3、NH4+、NO3-等尿素、牛肉膏、蛋白胨等用于合成蛋白质、核酸、以及含氮的代谢产物最常用的氮源是NH4+、NO3-附：NH3是硝化细菌的氮源和能源物质3、生长因子1）定义：2）种类：3）功能：4）特点：某些微生物生长不可缺少的微量有机物维生素（V）、氨基酸、碱基、胺类、固醇等一般是酶和核酸的组成成分微生物自身不能合成或合成能力有限特殊营养物质4、水和无机盐构成微生物酶的组成成分、调节渗透压等良好溶剂、生化反应介质5、此外还应满足微生物对pH以及氧的要求3、培养基的配制原则1）目的要明确2）营养要协调在谷氨酸生产中，当培养基中C:N=4：1时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸减少在谷氨酸生产中，当培养基中C:N=3：1时，菌体繁殖受到抑制而产生的谷氨酸增多3）pH要适宜细菌：最适pH为6.5---7.5放线菌：最适pH为7.5---8.5真菌：最适pH为5.0---6.04、培养基的种类和作用标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多微生物的分离、计数等半固体培养基加入琼脂较少观察微生物运动、鉴定菌种、保藏菌种等液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物选择培养基添加（或缺少）某种化学物质培养、分离出特定的微生物鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，可以鉴别不同种类的微生物如：在培养基中加入伊红和美蓝，可以鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌：若有大肠杆菌，其代谢产物（有机酸）就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞可抑制细菌、放线菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成其细胞壁是由纤维素、几丁质、葡聚糖组成菌落:单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。（二）无菌技术1、无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下四个方面（1）对实验操作的、操作者的，进行清洁和；（2）将用于微生物培养的器皿、和等进行；（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在附近进行；（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与相接触。空间衣着和手消毒接种用具培养基灭菌酒精灯火焰2、消毒和灭菌（1）消毒：消毒是指使用方法仅杀死物体表面或内部一部分的微生物，(包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有消毒法、消毒法、消毒法。（2）灭菌：灭菌是指使用杀死物体内外，(包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有灭菌、＿＿＿灭菌和灭菌。较为温和的物理或化学对人体有害不包括煮沸巴氏化学药剂强烈的理化因素所有的微生物包括灼烧干热高压蒸汽[思维激活]用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？70%与95%的酒精，哪一种效果更好？为什么？提示酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。消毒和灭菌的区别条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌消毒的方法：1、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min2、巴氏消毒法：70～75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用体积分数为50%～70%酒精溶液等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160～170℃下加热1～2h3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15～30min3.常用的消毒与灭菌的方法：是指用紫外线（能量）照射杀灭微生物的方法，紫外线不仅能使核酸、蛋白质变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，从而达到共同杀菌作用。1、灼烧灭菌：灭菌的方法：2、干热灭菌：160～170℃下加热1～2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃条件下维持15～30min。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手思考：三、实验操作三、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1.计算2.称量3.溶化4.灭菌5.倒平板操作步骤：配方：1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成培养基组分提供的主要营养牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10g碳源、氮源和维生素NaCl5g无机盐H2O定容至1000mL氢元素、氧元素倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。讨论：3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法①平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.平板划线操作1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红2.在火焰旁冷却接种环、并打开棉塞3.将试管口通过火焰。5.将试管口通过火焰，并塞上棉花。4.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。8.将平板倒置，放入培养箱中培养。7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作。在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区域相连。1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养划线分离法注意事项:其他画线分离图：1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。讨论：2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。②涂布分离法:是指将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个的细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等.结果分析与评价培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录菌种的保藏1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法1.提示：可以从微生物生长需要哪些条件的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度，食品保存可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。2.提示：可以从这三种培养技术的原理、操作步骤等方面分别进行总结归纳。例如，这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。3.提示：这是一道开放性的问题，答案并不惟一，重点在于鼓励学生积极参与，从不同的角度思考问题。例如，正是由于证明了微生物不是自发产生的，微生物学才可能发展成为一门独立的学科；巴斯德实验中用到的加热灭菌的方法导致了有效的灭菌方法的出现，而这一灭菌原理也适用于食品的保存等。旁栏思考题1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？解析许多微生物对人类是有害的，因此实验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答案无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。2．请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿。(2)玻璃试管、烧瓶和吸管。(3)实验操作者的双手。解析消毒和灭菌是无菌技术的两项基本技术，实践中需要根据无菌操作的对象合理地选择使用。原则是既要考虑使用的效果，又要考虑无菌操作对象的承受能力。答案(1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。倒平板操作讨论题1．培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答案可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答案通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3．平板冷凝后，为