转基因植物

CellEngineering2008转基因植物Chapter18：TransgenicPlant转基因植物将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。抗虫抗病抗逆生产药物由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80％，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。转基因植物外源基因：选择？克隆？植物细胞：受体细胞的种类？导入：方法？组织培养：（略）表达外源基因：如何检测、筛选？植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物生产的关键目的基因基因载体重组体分切接转筛表基因工程总体技术路线1983年，转基因烟草、胡萝卜问世1987年，转基因油菜、棉花产生1988年，转基因水稻、玉米诞生1992年，培育出转基因小麦1994年，培育出转基因大麦20余种植物产品通过FDA认证13个国家种植转基因植物转基因作物商业化：遍布6大洲2000年商业化种植面积比1996年翻了几倍预测：2020年世界上80％-90％的农作物将是转基因植物转基因植物研究发展第18章转基因植物TransgenicPlant•植物转基因技术•转基因植物的生产实践•转基因植物产品的检测•转基因植物的安全性一、植物转基因技术•基本技术路线•转基因的受体系统•外源基因导入的方法•转基因植物的筛选与检测（一）植物转基因的基本技术路线◆获得目的基因，克隆到载体上扩增◆受体细胞培养：如植物愈伤组织等◆目的基因导入受体细胞◆培养转化细胞◆筛选、培植、鉴定分离毒素蛋白基因将毒素基因插入到Ti质粒中制备抗虫转基因植物苏云金杆菌毒蛋白基因质粒载体重组质粒构建农杆菌棉花棉花细胞侵染转移转基因棉花抗虫棉的构建一、植物转基因技术•基本技术路线•转基因的受体系统•外源基因导入的方法•转基因植物的筛选与检测（二）转基因的受体系统◆组织受体系统（如：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染，并形成愈伤组织，可诱导分化出完整植株）◆原生质体系统（便于体外细胞和遗传操作）◆生殖细胞受体系统（1、单倍体培养诱导愈伤组织、转化；2、利用花粉和卵细胞的受精过程转化：类似转基因动物？）◆叶绿体转化系统（能直接表达原核基因）一、植物转基因技术•基本技术路线•转基因的受体系统•外源基因导入的方法•转基因植物的筛选与检测（三）外源基因导入植物受体的方法◆直接转化法（略）◆农杆菌介导转化法（1974年）◆基因枪法（1987年）◆植物病毒介导法1、农杆菌介导的基因转移：冠瘿瘤Ti质粒(tumor-inducingplasmid)转移DNA(transferDNA,T-DNA)Tiplasmid：双链共价闭合环状DNA分子，约150～200Kb发根农杆菌的生物学特性发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）：土壤细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物Ri质粒(root-inducingplasmid)：T－DNA区、Vir区两个功能区T－DNA区插入到寄主植物基因组中，表达决定发根生长和冠瘿碱合成的基因，冠瘿碱的检测是评价植物转化是否成功的证据之一Vir区不插入寄主植物基因组DNA中，但与T－DNA的转移有关，其缺失或突变不能使感染的植物出现发根LBRBviroriABGCDEopinecatabolismHairyrootgenesandopinesynthaseT-DNARiRi质粒T-DNAcontains:1)opinesysthesisgenes2)iaaM,iaaH—auxins3)iptZ--phytohormoneTiplasmid---circulardsDNAabout200kbTiplasmidofAgrobacteriumcausescrowngalltumors100多种双子叶植物！很少感染单子叶植物！T-DNA,partoftheTiplasmid,istransferredtoplantcells农杆菌与植物细胞相互作用的机制Ti质粒衍生的克隆转化载体•Ti质粒衍生的克隆转化载体必须具备以下的结构特点•1）具有选择标记基因•2）DNA复制起始位点•3）T－DNA右边缘序列•4）单克隆位点•5）vir区域，利用双元载体系统和共整合载体系统解决。共整合载体和农杆菌质粒重组过程双元载体标记基因启动子外源目的基因终止序列DNA---mRNA---蛋白质－性状T-DNAhasbeenmodifiedtoactasagenevector◆cointegrationvector◆binaryvectorcointegrationvector共整合载体binaryvector双元载体（1）binaryvector双元载体（2）4Reportergenesdemonstratetransgeneexpressioninplanttissues农杆菌共培养侵染诱导愈伤组织分化生芽生根叶盘转化法叶盘法双子叶植物较为常用、简单有效的方法。GeneGun2、GenegunsandelectricshockstransferDNAintoplantcells基因枪基因枪介导的DNA转移•基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。基因枪转化的原理决定基因枪使用成功的因素•第一因素是动力系统。•根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体作为动力。•第二因素是微弹的制备过程。用的微载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直径一般为0.6－4μm。•常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等。•第三个因素是受体材料的选择。microinjectioncell-to-cellinfection3、Virusescanbeusedasvectorsforwholeplants一、植物转基因技术•基本技术路线•转基因的受体系统•外源基因导入的方法•转基因植物的筛选与检测（四）转基因植物的筛选与检测◆报告基因（如：抗生素抗性、抗除草剂、显色或发光报告基因等）◆分子生物学方法（ELISA、PCR、分子杂交等）发展与展望•基因定向进化：点突变，基因重构•基因设计：根据蛋白质设计进行•高效表达系统构建：新的宿主及表达系统，基因表达调控，满足不同需要•多基因的共克隆与表达•代谢工程的设计Thepotentialuseofplantstoproduceproteinsisofcommercialimportance第18章转基因植物TransgenicPlant•植物转基因技术•转基因植物的生产实践•转基因植物产品的检测•转基因植物的安全性二、转基因植物的生产实践概念：运用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。与传统的常规育种有何区别？转基因植物通常至少含有一种非近源物种或种的遗传基因。•TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选转基因植物的分类抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面积最大）如Monsanto的抗除草剂草甘膦大豆抗虫转基因植物如Syngenta的Bt176抗虫玉米抗病转基因植物（抗病毒，抗真菌，抗细菌）抗环境胁迫转基因作物（温度、水分、化学物）植物发育调节基因工程（控制果实成熟，雄性不育，改良植物品质）医药领域中的转基因植物（利用植物作为生物反应器，生产药用蛋白、食用疫苗等）BarbaraMcClintock(1902-1992)NobelPrizein1983Scientificdiscoveriesinmid1940s外源基因表达相关问题◆空间定位、定向输送？◆特定组织中或可调控表达？◆提高表达水平的方法？◆使用信号肽◆选择组织特异性启动子或诱导型启动子◆使用强启动子、增强子、稀有密码子改造等遭受虫害的普通玉米抗虫的Bt转基因玉米转基因植物的生产实践：样品比较（左为普通棉花，右为兔毛转基因棉花）抗除草剂大豆荧光素酶基因在烟草中（1986）WMBarnesVariablePatternsofExpressionofLuciferaseinTransgenicTobaccoLeavesPNAS87:9183-9187.实例：抗TMV的转基因番茄转基因番茄与非转基因番茄相比：•毒性物质配糖生物碱（golycoalkaloids）的含量相同；•糖及有机酸组成相同；•多酚代谢产物组成相同；•番茄提取物对肠道菌的影响相同，没有诱发回复突变。土豆不宜带皮食用食用带皮土豆有害人体健康，因为土豆中含有有毒的配糖生物碱。这种配糖生物碱几乎全集中在土豆皮里，食用大量的配糖生物碱可以引起中毒。因此，土豆不宜带皮食用。即使带皮的土豆煮熟后将皮剥去，也会有部分的配糖生物碱渗入土豆内部，同样会引起中毒。抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒转查尔酮合酶矮牵牛花实例：抗除草剂甘膦转基因大豆转基因大豆与原始品种相比：•主要营养元素和抗营养因子无明显差别；•不引起过敏反应，对啮齿类的动物是安全的；•饲喂大鼠、鸡、乳牛、鲇鱼和鹌鹑，在饲料转化率及促进生长发育待方面无显著差异。抗除草剂作物实例：抗甲虫转基因马铃薯转基因马铃薯与原始品种相比：•Bt蛋白和NPTII蛋白对人无明显的过敏反应；•蛋白质、脂肪、碳水化合物、可食性纤维、灰分含量相同；•维生素C、B6、B1、B3、烟酸、叶酸含相同；•矿质无素钙、铜、铁、碘、磷、钾、钠、锌相同；•抗营养因子茄碱含量相同；•饲喂大鼠28天，两者在毛重、生长速率和器官毛重方面无差异能杀死棉铃虫的棉花抗虫棉与普通棉花的对比抗虫棉转抗虫基因的欧洲黑杨叶片与对照转SCK基因水稻与对照转乙肝抗原基因的西红柿预防乙肝转鱼抗冻基因的耐寒番茄抗CMV甜椒转基因蔬菜转基因水稻和小麦商业化生产步伐加快•2000年底，世界各国批准的商业化生产的转基因作物有100多种，包括12种农作物,涉及转基因食品达4000余种在美国市场•包装食品中转基因成分占60％,•转基因食品的总交易量:1996年2.35亿美元1998年12-15亿美元2000年30亿美元以上预计2005年60亿美元2010年200亿美元上市的转基因食品抗病毒和抗软化基因西红柿上市的转基因食品抗除草剂基因大豆抗虫基因玉米抗病毒基因油菜抗病毒土豆转抗虫基因棉花将上市的转基因食品脂肪含量高含β-胡萝卜素1996-2001年全球转基因植物种植面积(Km2)170110027803990442052600100020003000400050006000199619971998199920002001年度种植面积2001年转基因植物种植面积比例大豆63%油菜5%棉花13%玉米19%转基因植物种植面积增长速度第18章转基因植物TransgenicPlant•植物转基因技术•转基因植物的生产实践•转基因植物产品的检测•转基因植物的安全性三、转基因植物产品的检测目前已采用的检测方法：•核酸水平•蛋白质水平核酸（DNA），位于细胞核Nucleus蛋白质功能产物mRNA（信使RNA）由DNA转录而来转基因生物（GMO）的检测略图geneticallymodifiedorganism蛋白质检测方法•ELISA检测•试剂条快速检测核酸检测方法定性PCRPCR检测PCR-ELISA定量PCR目前应用方法的比较蛋白检测(ELISA)蛋白检测(LateralFlow)基因检测(PCR)检测时间少于10分钟否是否成本便宜是是否灵敏、准确、重复性好好好得出定量结果是否是国际上是否认可有效是/否否是/否检测所