SOP

SOP常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10MNaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。3、10%(g/V)氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competentcell）。将细菌置于0℃，低渗CaCl2溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短暂的热冲击处理（一般热休克90s）后能促进细胞吸收外源DNA复合物。2）仪器、材料与试剂：①超净工作台、低温离心机、摇床、-80℃冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及0.22um小过滤器各1个。高压灭菌的纸张、透气膜、1.5ml的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。②TB缓冲液：每200ml液体中含Mncl2.4H20(2.176g)、Cacl2.2H2O(0.44g)、Kcl(3.73g)、PIPES(0.67g)。（注：在电子天平上的误差③LB液体培养基：参见前面介绍。④LB固体培养基：参见前面介绍。⑤1管DH5α的菌种3）步骤：①倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37℃恒温培养箱中培养过夜。②在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌(菌的大小约2~3mm)转接于200~250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。③置于摇床上，18℃、200-250rpm速度摇约需3~5天，使OD600=0.4~0.7（对数生长期或对数生长前期）时开始制备。④取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4℃冰浴中，预冷低温高速离心机（4℃、2500rpm、10min）。⑤在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4℃中冰浴10min。⑥取出后放置于离心机上离心4℃、2500rpm、10min。⑦弃上清液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约5~15ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。⑧重复⑥+⑦的步骤一次。⑨在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。⑩分装成100-150ul/管（1.5ml的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80℃冰箱保存。4）转化效率的评估：①采用小量质粒快转（冰浴10min→42℃热休克90s→冰浴2min→加无抗性LB液体培养基200ul→37℃摇床复温培养30min）。②涂Kn、AP抗性板并做阴性对照（采用ddH20代替鉴定用的大提标准质粒），可以评价出是否有染菌、突变、转化效率。③可以用Er2566等感受态做平行对照，评估其的生长快慢情况及转化效率的高低。转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量（1ug/ul）,标准质粒为大提用的N31-EGFP。5）注意事项：①严格按照标准操作步骤，整个操作过程要注意温度（4℃冰上操作）且洁净的超净台环境防止污染。②直接从-80℃取出的菌株培养致敏后比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，一般是受体菌应处于对数生长期或生长前期即OD600=0.4~0.7。③转化鉴定时，42℃准确热休克90s不要振荡，迅速置于冰上2min,按照标准操作步骤进行评估。一般是感受态制备好在-80℃冰箱冻存2天后再做鉴定，更准确评估。④质粒分子量的大小对转化效率也有影响，一般来说，随着质粒分子量的增大，其转化效率会相应地降低。但当质粒在4.0kb~7.3kb时，所得的转化率基本一致。7、电转感受态制备：1）准备工作：（提前一天）1、250mlLB液体盛于1L三角瓶中；2、1L超纯水；500ML离心管两支；10%甘油400ML；3、1.5ml离心管和200ul枪头若干以上物品，120℃灭菌20分钟后置于4℃保存备用4、电转杯经纯水洗净后这置于75%乙醇浸泡5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37℃190rpm过夜振荡培养。2）感受态制备：1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于250mlTet抗性LB中，37℃240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达0.6(其间每1小时测一次OD，其值在0.4-0.8之间均可，但在0.6时效率最好)；2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。同时将前一夜置于4℃保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4℃；3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4℃离心10分钟；4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4℃下离心10分钟；5、重复步骤4两次；6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；在离心的过程中将离心管插入冰中预冷；7、充分弃上清，加入200ul10%甘油，要换瓶身，使沉淀充分悬起，用预冷的枪头按100ul/支分装细胞于离心管中；8、将分装好的细胞放入-80℃保存。3）质量控制：将电转杯从乙醇中取出，置于超净台中，用无菌风吹4小时从-80℃取出一支感受态，立即放入冰盒里；取1ul标准质粒（1ug/ml）加入感受态中，混匀后，加入预冷的电转杯中；将电转条件设为2.5，电击2-3秒，立即加入1mlSOC培养基并混匀；将混合物转入1.5ml离心管中于37℃，200rmp振荡恢复半小时；用LB将培养物稀释至103涂于Amp固体培养基上，倒置于37℃温箱中，过夜培养。计算效率：效率=菌落数×103×103。二、DNA操作系统1、溶液I:葡萄糖50mmol/L，EDTA10mmol/L，Tris-HCl25mmol/L，pH8.0。2、溶液II:NaOH0.2mol/L，SDS1%，用ddH2O现配现用。3、溶液Ⅲ:取5mol/LNaAc60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。4、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。5、TE缓冲液:10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，灭菌后使用。实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。6、0.1mol/LCaCl2:在适量纯水中溶解54gCaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。7、10×DNA上样buffer：母液：以500ml为例：蔗糖：200g，溴酚蓝：0.2g，取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4℃保存。*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与PH值有关；存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。染料：SYBERGreenI（MolecularProbe）10,000×每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。分装于避光管中，即为10×DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4℃保存。*配制者需督促使用者及时将避光管放回4℃，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。8、RNaseA（DNasefree）：RNaseA干粉（Ameresco）溶解于0.01mol/L的CH3COONa（pH5.2）中，使终浓度为1mg/ml，加热至100℃，15min，室温冷却。用0.1体积的1MTris-Cl调pH至7.4后，分装，于-20℃冻存。*500ul/管分装，供分子克隆实验使用；3ml/管分装，供大提质粒使用。RNaseA干粉需提前订购，及时检查使用情况。三、蛋白质操作系统（一）、电泳1、30%丙烯酰胺将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。补加水至终体积为100ml。以0.45μm孔径过滤溶液，去除不溶性杂质。查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。注意事项：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。2、1.5MTris-HCl(pH8.8)400ml水中溶解Tris-Base90.855g,浓盐酸调PH至8.8后定容至500ml3、1.0MTris-HCI(pH6.8)400ml水中溶解Tris-Base60.57g,浓盐酸调PH至6.8后定容至500ml4、10%SDS900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。5、10％过硫酸铵称取过硫酸铵2g，适量水溶解后，定容至20mL，分装成1mL/管，于-20℃保存备用。6、蛋白上样Buffer（6×蛋白加样缓冲液）称取十二烷基硫酸钠12g、溴酚蓝0.6g，1MTris-Cl(pH=6.8)30ml、甘油60ml、β－巯基乙醇5ml，定容至100ml。7、蛋白质电泳buffer（5×）称取三羟甲基氨基甲烷15.1g、甘氨酸94.0、十二烷基硫酸钠5.0g,在水中溶解并定容至1L。（二）染色1、染色液（考马斯亮蓝染液）甲醇45％，冰乙酸10％，去离子水45％，加考马斯亮蓝R-250或G-250至0.25%，过滤后使用。2、10×脱色液称取KCl186.5g，加水定容至1L3、蛋白快速银染所需溶液（1）固定液：400mL甲醇，500uL甲醛，加水定容至1L；（2）20%AgNO3溶液：20gAgNO3加水定容至100mL；（3）Na2S2O3溶液:0.32gNa2S2O3·3H2O,加水定容至1L；（4）显色液（未加甲醛）：30gNaCO3,20mL上述Na2S2O3溶液，加水定容至1L，（临用前加入甲醛，甲醛量如何确定？）。（5）2.3M柠檬酸：483.22gC6H8O7·3H2O,加水定容至1L。（三）杂交1、电转液：称取Tris－Base18.2g，甘氨酸86.5g，先加4L水溶解，再加甲醇1200ml,定容至6L。2、10×TN：称取NaCl438.3g,Tris60.57g,加入浓盐酸调节至PH8.0，定容至5L。3、封闭液（WB用）：称取5g脱脂奶粉，加入TN，定容至100ml。4、TNT：TN中加Tween-20至0.05%。5、AP底物：氯化钠2.902g，MgCl2.6H2O0.508g，Tris－