【实验研究】 小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作 技术及技巧探讨

【实验研究】小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨作者简介:孟丽娜,女,1975年4月出生,山东人,在读硕士研究生,主治医师。研究方向为眼底病。联系电话:159********;E2mail:mln_jn@:Female,borninApril,1975.Postgraduatestudent.Tel:159********;E2mail:mln_jn@收稿日期:2021206219修回日期:2021206230本文编辑:徐刚珍△基金项目:国家自然科学基金资助(编号:30772386);科技部973计划前期研究专项基金资助(编号:2021CB516705);山东省自主创新重大科技专项计划基金资助(编号:2021GG1102021)作者单位:266071山东省青岛市,山东省眼科研究所,山东省眼科学重点实验室———省部共建国家重点实验室培育基地通讯作者:董晓光,E2mail:dxgdoctor@hotm:Jun19,2021Accepteddate:Jun30,2021Foundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No:30772386);NationalDepartmentofScienceandTechnologyunderPrelimi2naryBasicResearch973Project(No:2021CB516705);ShandongProvinceSpecialAutonomyPlanMajorScientificandTechnologicalInnovationFund(No:2021GG1102021)FromtheStateKeyLaboratoryCultiva2tionBase,ShandongProvincialLabo2ratoryofOphthalmology,ShandongEyeInstitute,Qingdao266071,Shan2dongProvince,ChinaResponsibleauthor:DONGXiao2Guang,E2mail:[e-mail]【实验研究】小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨△孟丽娜刘廷董晓光OperativetechniquesandskillsofstretchedpreparationofretinaafterangiographyinmiceMENGLi2Na,LIUTing,DONGXiao2Guang【Keywords】angiography;tissuefixation;stretchedpreparationofretina;mouseeyeball【Abstract】ObjectiveToinvestigateaneffective,simpleandnormativetech2niqueforstretchedpreparationofretinaafterangiographyinmice.MethodsThirtyC57BL/6Jmiceatpostnatal12daysto17dayswereanesthetized,andinfusedwith20g?L-1Evansbluethroughthesuperiorvenacava.After5minutes,themicewerekilled,andtheeyeballsoftwoeyeswereenucleated.Alleyeballsweredividedrandomlyintothreegroups,20eyeballsineachgroup,andfixedin40g?L-1paraformaldehydefor10minutesingroupA,20minutesingroupBand40minutesingroupC,respectively.Afterthecornea,iris,lens,vitreousbodyandsclerawereremovedunderoperatingmicro2scope,theretinawastiledontheslide.Thedifferencesamongthreegroupswereob2servedwithphotographunderfluorescencemicroscope.ResultsJustwithgeneralobservation,theretinasbecamebig,thinandoutofshape,andtheareaofretinabecamesignificantlylargeingroupA.Theshapesofretinaswereunchangedandwithoutdisfig2urationingroupB.Blackpigmentepitheliumlayeradheredontheretinas,andnoteasilytobedissolvedingroupC.Withphotographunderfluorescencemicroscopy,theretinavesselswereobscureandoutofshapeingroupA;TheretinalvesselshadanuniformdistributioningroupB;Blackpigmentepitheliumlayerpartlyadhered,andthevascularbackgroundimagingwasuneveningroupC.Thesuccessfulrateofstretchedprepara2tionwas30%ingroupA,90%ingroupBand30%ingroupC,respectively.Conclu2sionAgood,normativetechniqueandcorrecttimeforfixationwithparaformaldehydearekeyfactorsforthesuccessofstretchedpreparationofretinaafterangiographyinmice.[RecAdvOphthalmol2021;29(9):6632666]【中图分类号】R774.1【文献标志码】A【文章编号】100325141(2021)0920663204【关键词】血管造影;组织固定;视网膜铺片;小鼠眼球【摘要】目的探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片技术。方法30只生后12～17d龄C57BL/6J小鼠麻醉后行20g?L-1伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取双眼眼球,40g?L-1多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,C组20只眼球固定40min,手术显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体及巩膜,并将视网膜平铺于载玻片上,荧光显微镜下照相,观察各组差异。结果大体观察:A组视网膜变大、变薄、变形,视网膜面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜黏附黑色视网膜色素上皮层,不易分离。荧光显微镜下照相观察:A组铺片成功率为30%,视网膜血管变形,模糊不清;B组铺片成功率为90%,视网膜血管均匀规则分布;C组铺片成功率为30%,黑色视网膜色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀。结论良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键。[眼科新进展2021;29(9):6632666]视网膜新生血管性疾病是一类严重危害视力的致盲性眼病,眼科基础研究中常采用氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型[1]探讨其发生机制。在小鼠动物实验中,由于小鼠眼球较小,无法直接进行眼底血管观察,血管灌注造影视网膜铺片是研究血管性视网膜疾病常用的技术方法。但视网膜铺片操作中RecAdvOphthalmolVol.29No.9September2021常出现血管灌注不足、眼球固定时间过长或过短、展片困难且不完整不均匀等技术问题,严重影响实验结果的分析比较。在本实验中,我们对应用多聚甲醛固定眼球时间的不同进行比较,并结合视网膜铺片过程中的一些实验技巧改进,取得了良好结果,现报告如下。1材料与方法1.1材料C57BL/6J12～17d龄小鼠30只,雌雄不限,购自中国医学科学院实验动物研究所。20g?L-1伊文蓝溶液:1g伊文蓝(Evansblue,美国Sigma公司)溶于50mL生理盐水中,震荡溶解,过滤,4℃低温避光保存,使用前取适量预热至37℃备用。40g?L-1多聚甲醛溶液:多聚甲醛4g,加入0.1mol?L-1PBS100mL,加热至60～70℃,不断搅拌,并滴加1mol?L-1的NaOH直至液体变清为止,调整pH值至7.2～7.4。眼科实验手术显微镜(PICOi,Zeiss,德国),荧光显微镜(NiconEclipaseE800,日本),小梁剪刀、角巩膜剪刀、维纳斯剪刀、显微有齿镊子、显微无齿镊子(苏州明仁医疗器械有限公司)等。1.2方法盐酸氯氨酮(0.1g?kg-1)、盐酸氯丙嗪(0.125g?kg-1)腹腔注射麻醉,仰卧位固定四肢,头偏向一侧,手术显微镜直视下作颈部皮肤切口并分离至见充盈的上腔静脉血管(图1A),29G针头穿刺入上腔静脉血管内注射20g?L-1伊文蓝0.3～0.5mL(图1B),注射约5min见小鼠通体变为蓝色,尤其口唇和四肢(图1C),表明灌注成功。立即摘取双眼眼球,置于40g?L-1多聚甲醛溶液中并分别固定10min(A组,20眼)、20min(B组,20眼)、40min(C组,20眼)后,在手术显微镜下用角巩膜剪沿眼球的角巩膜缘剪开,除去角膜、虹膜、晶状体和玻璃体,将视网膜以视盘为中心,放射状切开4刀,置于载玻片上,用显微有齿镊小心将巩膜翻转,完整分离出视网膜,平铺于载玻片,滴少许无菌用水后盖上盖玻片,立即置于荧光显微镜绿色荧光下观察、照相。视网膜组织完整无破损的铺在载玻片上即为铺片成功。Figure1A:Thearrowshowedmice’ssuperiorvenacava;B:20g?L-1Evansbluewasinjectedintothemice’ssuperiorvenacava;C:OrallipandfourlimbsturnedblueinmiceinjectedwithEvansblue(arrow)comparedwithnormalmiceA:箭头示小鼠上腔静脉;B:上腔静脉穿刺注入20g?L-1伊文蓝;C:注射伊文蓝小鼠(箭头)较正常小鼠口唇、四肢变蓝2结果2.1大体观察肉眼可以看到载玻片上A组视网膜软,盖玻片盖后视网膜迅速变大、变薄、变形,面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜表面黏附大量黑色视网膜色素上皮层,不易分离(图2)。Figure2A:a:Theretinasbecamebig,thinandoutofshapeingroupA;b:TheshapesoftheretinaswereunchangedandwithoutdisfigurationingroupB;c:ConsiderableblackpigmentepitheliumlayeradheredontheretinasingroupC(arrow).B:Noblackpigm