埃博霉素的生物合成

埃博霉素的生物合成药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2021,16(2):175～181埃博霉素的生物合成①阎家麒(福建紫杉园生物有限公司,福建明溪365200)摘要埃博霉素是由黏细菌纤维堆囊菌产生的次级代谢产物。与紫杉醇相似,它们可以抑制微管解聚,使细胞有丝分裂终止在G22M期。在P2糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中维持很大的毒性,而且比紫杉醇有更好的水溶性。全合成埃博霉素虽然可以实现,但是与发酵方法相比尚无经济可行性。本文介绍了埃博霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达,同时也对Red/ET重组技术的特点以及在埃博霉素生物合成中的应用进行了详细阐述。关键词埃博霉素(埃坡霉素,埃坡西龙);生物合成;埃博霉素基因簇;埃博霉素D内酰胺衍生物;Red/ET重组技术中图分类号:TQ465文献标识码:A文章编号:100528915(2021)022175207埃博霉素(埃坡霉素,埃坡西龙,epothilones)是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体,噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物,是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物(图1)。Fig1epothilones1埃博霉素的发现埃博霉素A和B是在20世纪90年代由Hfle及其同事最先从南非Zambesi河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangiumcellulosum(Myxococcales)菌株Soce90,从其培养物中分离提取了一种抗真菌活性的化合物并对其进行性质研究[1,2]。首先用光谱和X-射线衍射晶体学方法测定了埃博霉素的结构排布,该化合物是依据它的结构亚单位,epotide,thiazol和ketone命名的(图2)。Fig2Thenamingofepothilones1995年前后,Bollag等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。这一结果立即引起许多有机化学家、生物学家、药学家及临床医生的极大关注,在国际上迅速开展了对埃博霉素的多角度研究。2埃博霉素化学生物学埃博霉素外观为无色油状,可在乙酸乙酯中形成粉末状结晶。上述埃博霉素A、B、C、D、E5种分子结构仅存在微小差别。埃博霉素总共有7个手性中心和一个大环,包括含有噻唑的侧链与一个环氧化物。2.1微管聚合与解聚微管(microtubule)存在于几乎所有的真核细胞中,是有丝分裂期纺锤体、纤毛及鞭毛基体的主要成分。微管为中空柱状结构,外径约24nm,壁厚约5nm,其长度因细胞种类和功能不同而异。微管由α、β微管蛋白(tubulin)形成的异二聚体(heterodimer)为基本结构单位组装而成,α和β微管蛋白均为球蛋白,直径约5nm,α、β微管蛋白头尾相接交替排列成原丝(protofilament)。13根原丝沿微管纵轴环状排列而成筒状。α、β微管蛋白二聚体是有极性的,即α微管蛋白总是位于一侧,β微管蛋白位于另一侧。因此,由α、β微管蛋白二聚体为组装单位形成的多聚体也存在极性,即一端为α微管蛋白(正极),另一端为β微管蛋白(负极)。微管的这种极性在其组装和执行功能过程中发挥着重要作用。细胞提取物在37℃、无Ca2+存在、加入GTP的条件下,微管可自发形成,当温度降低,则微管解聚[3]。2.2以微管或微管蛋白为靶点的药物及其结合位点埃博霉素、紫杉醇、长春碱(vinblastin)和秋水仙碱571①收稿日期:2021208219修回日期:2021212215作者简介:阎家麒,1939年生,男,教授,专业方向:基因工程制药,天然产物有机合成。Tel:158********E2mail:[e-mail]。(colchicines)都是作用于微管蛋白的天然药物,但它们的结合位点和作用机制不同。与紫杉醇结合位点相互作用的药物包括埃博霉素及其衍生物等。这些是另一类抗有丝分裂抗肿瘤药物,具有促进微管的聚合与稳定性的作用。实验研究表明,埃博霉素具有与紫杉醇相类似的稳定微管活性,其作用机制主要是,埃博霉素在低温、无GTP或微管偶联蛋白(MAPs)和在Ca2+存在的条件下与β微管蛋白N端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸结合,促进微管蛋白聚合,装配成微管,抑制其解聚,从而导致微管束排列异常,形成星状体,使纺锤体失去正常功能,导致染色体分离受阻,细胞核不能分裂,使得细胞有丝分裂终止在G22M期,从而引起细胞毒性导致细胞死亡[4]。有研究认为,埃博霉素A和B是[3H]紫杉醇连接的竞争抑制剂,与紫杉醇具有几乎相同的IC50值,埃博霉素在结合到微管上时,占有不同的但可能是重叠的结合位点。是紫杉醇结合到微管蛋白聚合物的竞争性抑制剂。与紫杉醇比较,埃博霉素水溶性好,注射、口服均可;结构简单,有利于化学合成及衍生化;在P2糖蛋白表达型的多药耐药性(MDR)细胞中也维持很大的细胞毒性,约为紫杉醇的2021～5000倍[5]。3埃博霉素的全合成与紫杉醇比较,埃博霉素的化学结构相对简单,所以化学合成埃博霉素及其衍生物成为近年来生物有机化学家们关注的热点。埃博霉素是一种结构复杂的天然产物,天然产物的有机合成可谓是20世纪后十年对有机化学巨大挑战。埃博霉素一问世,有数十条全合成路线相继报道。其中,卓有成效的是Nicolaou、Danishefsky和Schinzer等3个小组[6～8]。从1993年发现至今(2021年10月),有关埃博霉素研究报告的文献量约有500多篇。国外报道全合成埃博霉素的方法路线不下30余种。但是,具有商业价值的全合成方法必须具备合成步骤短、最长线性片段少、总产率高这3个优势。在上述3个研究小组的全合成方法中,Danishefsky大环羟醛缩合方法、Nicolaou大环内酯化方法、Schinzer烯烃复分解方法、Nicolaou烯烃复分解方法和Danishefsky烯烃复分解方法具有一定的可行性,如表1。Tab1SynthesisofNicolaou,SchinzerandDanishefskygroupsSynthesisTotalstepsLongestlinearsequence(LLS)OverallyieldalongLLSDanishefskyMac2roaldol37242.6%NicolaouMacro2lactonization27204.3%SchinzerRCM33171.1%NicolaouRCM1596.6%DanishefskyRCM25220.8%埃博霉素全合成工作亦于上世纪末在我国展开[9,10],这在探索埃博霉素大规模制备的可行性上,具有很重要的意义。全合成埃博霉素步骤冗长,产率颇低,现有文献提供的方法目前尚无工业化实用意义。4埃博霉素生物合成4.1诱变育种以纤维素堆囊菌培养方法进行埃博霉素的大规模生产是理想的途径。但是目前微生物发酵方法生产埃博霉素的产量都很低。1996年Hfle等人的经典报道[2],以Soran2gumcellulosumSoce90为生产菌株,埃博霉素A和B产率分别为22mg/L和11mg/L。遗憾的是,该结果没有被后来的研究者们所证实。近10年中,在生物合成埃博霉素的研究上又有新的进展,如李越中等[11]对成团生长的纤维堆囊菌液体均衡生长的驯化,采用适合埃博霉素A产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及综合的消除产物代谢积累的混合树脂添加方法等步骤,使得埃博霉素A的产量达到62.7mg/L的水平。但是该方法需要重复传代驯化,在100代时方可达到上述产率水平,每传1代至少12d,100代则需1200d(3年多),即使在此期间不发生菌种退化、变异等问题,这样冗长的生产周期显然不适合大规模生产。邱荣国[12]采用定向诱变筛选方法,获得了一种以埃博霉素D为主要代谢产物的新菌株S.celulosumBGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能,在其他条件相同的情况下,该类菌株只产生埃博霉素C和D,而不产生埃博霉素A和B。这一诱变菌株可通过一次或者多次的基因诱变及定向筛选(产物鉴定)而获得。美国施贵宝公司将Soce90菌株经过UV诱变继之以随机选择产生Soce90B2菌株,然后再用亚硝基胍(NTG)诱变,得到高产菌株(SC16408)[13]。传统的生物发酵仍然聚焦在采用诱变的方法获得高产菌株,优化发酵条件和纯化工艺。目前,通过纤维堆囊菌发酵合成埃博霉素的手段仍然存在很大的局限性。首先纤维堆囊菌的分离和纯化工作繁琐,生产周期较长。此外,从发酵液中分离、提纯产物的方法有待进一步优化。目前,埃博霉素传统的工业菌株育种技术仍然具有实用价值。4.2埃博霉素的异源表达在埃博霉素异源表达的研究方面,美国Kosan生物技术公司建立了埃博霉素来源菌株的基因文库,构建了含有埃博霉素合成酶基因的载体。他们将埃博霉素基因转入到和纤维堆囊菌同目的黄色黏球菌(Myxococcusxanthus)中,表达出了埃博霉素A和B[14]。埃博霉素C和D在原始菌2纤维堆囊菌中不易获得。由于黏球菌和纤维堆囊菌同源性高,这种异源表达有效地避免了产物对宿主细胞的内毒素作用。并且黏细菌代时短(约为5h,纤维堆囊菌一般为16h),易于遗传操作,埃博霉素生物合成基因酶在该宿主中671药物生物技术第16卷第2期异源表达具有一定优势。通过优化发酵条件以后,该工程菌M.xanthusK11124021发酵合成埃博霉素D的平均产量可以高达23mg/L[15,16]。这种方法得到的埃博霉素D已经进入临床试验。现在他们又将埃博霉素基因转入到了大肠杆菌(Escherichiacoli)[17]中。虽然大肠杆菌表达需要外添加前体,而且最终产量很低,但是它为组合文库的发展提供了一个手段,异源表达可以克服纤维堆囊菌生长迟缓、发酵困难的缺点,为大规模生产埃博霉素提供了一种新的方法。4.3Red/ET同源重组技术在埃博霉素生物合成中的应用Red/ET重组技术是本世纪基因工程的创新技术,极大地促进了分子生物学的发展。Red/ET重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点,在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、插入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可以是基因组DNA。该技术成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。张友明等[18]采用Red/ET同源重组技术和异质宿主菌,使埃博霉素的全长基因簇完整地缝合在一起,并转化到新的宿主菌中,解决了埃博霉素大全长基因簇的克隆和原始生产菌发酵产率低、发酵周期长等问题。埃博霉素生物合成主要是由I型聚酮合酶(PKS)催化完成的[19],埃博霉素的复合酶系统中同时含有PKS和NRPS(非核糖体肽合成酶)模块,包括1个负载模块,1个非核糖体肽合成酶模块,8个聚酮合酶模块和1个能把脱氧埃博霉素转变成环氧埃博霉素的P450环氧酶。整个基因簇中有7个转录方向一致的基因(epoA,epoB,epoC,epoD,epoE,epoF和epoK),9个模块和46个结构域。埃博霉素生物合酶全长约56kb,埃博霉素生物合酶依照转录顺序依次是:epoA(149kD,编码1个负载模块)epoB(158kD,1个NRPS模块)epoC(193kD,1个PKS模块2)epoD(765kD,4个PKS模块326)epoE(405kD,2个PKS模块7和8)epoF(257kD,1个PKS模块9加1个硫酯酶)epoK(47kD,1个细胞色素P450),同时由于epoA/epoB,epoC/epoD中存在基因的重叠现象,推测epoA/epoB,epoC/epoD可能共转录。而在epoB/epoC(147bp),epoE/epoF(15bp)和epoF/epoK(115bp)基因之间短小的间区序列中没有发现转录终止子,这表明所有这些基因可能是由一个异常大的操纵子(≥56kb)构成。根据同位素13C标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测,埃博霉素的生物合成包括5个阶段:①聚酮链的引发:在酰基转移酶