微生物资料

微生物资料实验一常用培养基的配制实验目的1.掌握实验器皿的清洗和包扎方法2.掌握常用微生物培养基配制的一般方法和操作步骤3.掌握高压灭菌的原理和操作步骤器皿的清洗和包扎培养基的配制高压蒸汽灭菌器皿的清洗试管、培养皿、三角瓶、烧杯等玻璃器皿的清洗用瓶刷或海绵沾上洗衣粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。玻璃吸管的清洗吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，以免干燥后难以冲洗干净。吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2％煤酚皂溶液24小时后方可取出冲洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。载玻片与盖玻片的清洗用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5～10分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95％酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。器皿的包扎培养皿的包扎培养皿常用牛皮纸密密包紧，一般以5～8套培养皿作一包，包好后进行灭菌。试管和三角烧瓶等的包扎试管和三角瓶盖上铝帽或者塑料帽后用牛皮纸包扎，进行灭菌。包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。器皿的清洗和包扎小结微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包扎方法均有一定的要求。一般来说，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包扎方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器皿。包扎并灭菌后备用。培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基（培养一般细菌用）牛肉膏3g蛋白胨10调节pH至7.2～7.4NaCl5g琼脂15～20g水1000ml实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。培养基要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。实验器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养皿，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH6.4~8.0）等。实验步骤1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入三角瓶中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入三角瓶(琼脂在调节好pH后加入)。2.溶化在上述三角瓶中可加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3.调节pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.２～7.4。反之，则用1mol/LHCl进行调节。4.灭菌将上述培养基以121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。5.倒板将灭菌后的培养基冷至50℃左右，取出高压过的培养皿，制备牛肉膏蛋白胨培养基固体平板。培养基的配制小结注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。高压蒸汽灭菌的原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压蒸汽灭菌方法1.将灭菌篮取出，再向锅内加入适量的水，使水面与底孔相平为宜。2.放回灭菌篮，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与壁面接触。3.关闭高压锅盖排气阀，设定工作状态，本实验用121℃，20分钟灭菌。4.灭菌所需时间到后，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成管塞沾染培养基而发生污染。5.将取出的液体灭菌培养基放入4℃保存，如果是制备固体培养基平板要待固体培养基温度降至50℃左右制备平板，固体培养基平板也放4℃保存。实验二土壤微生物的分离鉴定实验目的1.掌握微生物的分离鉴定原理。2.通过从土壤中分离微生物，初步掌握微生物的分离鉴定方法。实验原理该实验采用平板分离法，本方法由于操作比较简单，普遍应用于微生物的分离和纯化。其原理主要包括两方面：1.在适合于微生物的生长条件（如营养、温度、酸碱度、氧气等）下培养待分离微生物，或者加入某种抗生素形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，进而筛除一些不需要的微生物2.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖形成的。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养的微生物。获得单个菌落的途径可通过稀释涂布平板或平板划线等方法来完成。实验器材（一）牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒,离心管（50ml）,培养皿，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，无菌操作台，恒温培养箱，移液枪（枪头），pH试纸（pH6.4~8.0)。（二）土样实验步骤1.配制培养基牛肉膏蛋白胨培养基调节pH至7.2～7.4牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15～20g水1000ml2）121℃灭菌20min，倒平板固体培养基。2.制备土壤稀释液称取10g土样，放入盛有90ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min使土和水充分混合，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的离心管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.1、0.01、0.001和0.0001不同稀释度的土壤溶液。(本实验采用50ml离心管盛无菌水)3.涂布培养把0.01、0.001和0.0001三个浓度的土壤稀释液作为涂布平板的含待分离微生物的菌液，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基上，共有9个培养基平板，标号，37℃温箱培养24~48h。4.划线分离（划线培养）对土壤稀释溶液微生物的培养基平板进行观察，记录区分明的细菌特征。挑取此细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号，37°C温箱培养。5、初步鉴定对菌体进行革兰氏染色观察，记录结果。注意事项制备土壤稀释液时，要注意应使土样均匀分散在稀释液中。无菌操作。实验三革兰氏染色实验目的1.理解革兰氏染色的原理。2.掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。实验原理X革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的。X在染色过程中，当用乙醇处理时，肽聚糖脱水而孔障缩小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色，用G+表示。实验原理革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶解的类脂质含量高。X当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色，用G-表示。实验器材（一）金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、土壤分离细菌。（二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；Lugol碘液；95%乙醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸，洗瓶，废液缸等。（三）光学显微镜。实验步骤一、细菌涂片的制作1.取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。2.再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。3.将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。待涂片冷却后，再加染色液。二、革兰氏染色1.初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色约1分钟后水洗。2.媒染：滴加Lugol碘液染色1分钟，水洗。3.脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出的酒精刚好不出现紫色，大约20秒钟，立即用水洗。4.复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。三、涂片观察先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。四实验完毕后的处理：1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去b.用擦镜纸沾少许二甲苯（N）将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。`+注意擦镜头时向一个方向擦拭。2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。注意事项涂片后要注意固定、干燥，以免标本被冲洗掉。2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格界定。3.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。4.选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。实验四细菌的芽孢染色实验目的1.了解细菌的芽孢染色原理。掌握细菌的芽孢染色方法。实验原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。，透性低、着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料如孔雀石绿在加热条件下进行染色时，弱碱性染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢。●进入菌体的染料通过水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。●用复染液（番红）染色，菌体和芽孢因呈现不同的颜色而易于区别实验器材一（）显微镜，香柏油，二甲苯，载玻片，镊子，酒精灯，滴管，烧杯，接种环，5%孔雀石绿染色液，番红染色液，吸水纸。（二）苏云金芽孢杆菌枯草芽孢杆菌实验步骤1.取干净载玻片，加一滴单蒸水，然后用接种环挑取适量苏云金芽孢杆菌涂片。2.将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反面，以不汤手为宜），对标本进行干燥、固定。3.在涂片上加2～3滴孔雀石绿染色液，然后在酒精灯上缓缓加热（注意不能使染色液沸腾），必要时可再滴加少许染色液。加热时间从冒蒸汽时开始计算2～3分钟。4.倾掉染色液。等待玻片冷却后，用水冲洗至无染色液为止。５.用番红复染１～２分钟，水洗至无染色液，用吸水纸除去残留水分。６.用油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。注意事项１.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。２.染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。实验二微生物对大分子物质的水解利用实验目的1.通过了解不同细菌对不同的生物大分子的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性。进一步学习平板接种法和穿刺接种法实验原理微生物具有很强的分解能力。微生物在自然界物质循环中的重要、不可替代的作用主要通过其强大的分解者而体现。微生物通过其酶系统将大分子物水解后的产物，即可自我利用，也可被其他生物利用。1.微生物存在环境中的大分子物质，如：淀粉、蛋白质、油脂等，一般不能被微生物直接吸收利用，需经微生物产生的酶分解成小分子物质后，才可吸收利用。2.不同的微生物可产生不同的分解相应大分子底物的酶，如：淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等。微生物的产酶特性是由该微生物的遗传特性所决定的，测定微生物的相关生理生化反应是微生物分类鉴定的依据之一。实验器材（一）牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，可溶性淀粉，明胶，植物油，1mol/LNaOH，1mol/LHCl，三角瓶，烧杯