SN 0331-1994 出口畜产品中炭疽杆菌检验方法

食品标准网（）SN0331-94中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口畜产品中炭疽杆菌检验方法Methodsfortheinspectionofbacillusanthraxinanimalby-productsforexport代替ZBX09010—861主题内容与适用范围本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。本标准适用于出口鬃、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌的检验。2设备和材料2.1离心机：带容量在500mL以上的离心管。2.2恒温培养箱：36±1℃。2.3恒温水浴：30～65℃。2.4生物学显微镜。2.5三角烧瓶：容量250mL、500mL和1000mL,带胶塞。2.6平皿：直径90mm或100mm。2.7试管：10mm×120mm和20mm×140mm。2.8吸管：1ml和10ml,带0.01mL和0.1mL刻度。2.9L形玻璃棒。2.10注射器：1mL带5号针头。2.11棉拭子：长180mm的竹签或铁丝,一端裹20～30mm长的棉球,用水浸湿,另一端裹在试管的棉塞内,插入试管高压灭菌。2.12棉布袋：70mm×130mm,带缩口绳。2.13养鼠罐。3培养基和试剂3.1溶菌酶多粘菌素琼脂：见A1。1食品标准网（）3.2戊烷脒多粘菌素琼脂：见A2。3.3营养肉汤：见A3。3.4营养琼酯：见A4。3.5洗样液：见A5。3.6生理盐水：见A6。3.7缓冲生理盐水：见A7。3.8固定液：见A8。3.9炭疽杆菌噬菌体：见A9。3.10革兰氏染色液：见A10。3.11大豆凝集素稀释液：见A11。4抽样4.1鬃、毛、绒、生骨粒4.1.1抽样数量按生产日期或原料来源划分批次。每批按30％开包(箱)抽样或在扎包(装箱)时由每包(箱)各取一份样品。4.1.2抽样方法用火焰灭菌的镊子或戴经消毒的乳胶手套从每包(箱)的不同部位共抽样3～5g,装入灭菌棉布袋内,将袋口扎紧,作上批次标记。4.1.3送样将样品装入塑料袋或铁桶内,密封后送样。4.2动物毛皮4.2.1抽样比例逐张取样。4.2.2抽样方法用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管,塞紧棉塞。4.2.3送样将试管逐支用纸包裹,装入铁桶内,再用棉花或软纸填充空隙,密封后送样。5样品处理2食品标准网（）5.1鬃、毛、绒、生骨粒5.1.1根据样品多少将适当数量的同批样品(昀多不超过10份)合编为一个检验样品单位,作好记录。5.1.2从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取1～2g样品,一起放入一个适当大小的灭菌三角烧瓶中。5.1.3加样品量30～40倍(W/V)的预冷洗样液于三角烧瓶,用灭菌胶塞将瓶口塞严。5.1.4将三角烧瓶放入冰水浴或0～4℃冰箱内,间或摇动约1h。5.1.5将瓶中洗样液倒入500mL灭菌离心管内,盖住管口,以3000r/min离心20min。5.1.6弃去上清液(注意防止污染),加少许灭菌水,使沉淀均匀悬浮。5.1.7将离心管静置5～10min,待杂质下沉后,将上悬液移入另一支灭菌试管内,于65℃恒温水浴加热30min。5.1.8加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验,应贮于0～4℃冰箱内,以防芽胞发芽。5.2动物毛皮如不立即检验,将棉拭子放于0～4℃冰箱内。6检验方法6.1分离培养6.1.1鬃、毛、绒、生骨粒6.1.1.1根据每管所包括样品份数之多少,各接种1～3个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接种时,用灭菌吸管吸取样液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有剩余样品,可增接数个平板,直至将样品接种完。6.1.1.2用灭菌L形玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多,可将平板置于36±1℃温箱,微开皿盖,使样液迅速干燥。6.1.1.3翻转平皿,置于36±1℃恒温箱,培养24～48h。6.1.2动物毛皮6.1.2.1将棉拭子由试管内取出,各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。6.1.2.2翻转平皿,置于36±1℃恒温箱,培养24～48h。6.2菌落及菌形观察6.2.1将培养的平板取出,用肉眼,必要时借助放大镜观察有无典型炭疽杆菌菌落。炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察,边缘呈卷发状,3食品标准网（）用接种针探触,有粘滞感,挑之,可拉起丝。6.2.2从典型或可疑菌落取培养物制备涂膜,经革兰氏染色,镜检。炭疽杆菌被染成蓝紫色,由多个菌纵连成长链。少数单个菌呈大杆状,两端平齐。有的菌体中央可见卵圆形不着色的芽胞。芽胞不使菌体膨大。6.3肉汤培养特性观察取菌落和菌形均似炭疽杆菌的培养物,接种肉汤管,于36±1℃恒温箱培养5～12h,观察细菌生长情况。炭疽杆菌在肉汤中生长初期的特征是：肉汤上部澄清,无菌膜,下部有絮状沉淀,沉淀不易摇散。6.4确定试验6.4.1大豆凝集素吸收试验6.4.1.1方法a.加大豆凝集素稀释液(A11)一滴于比色板或载玻片上。b.用接种环取一满环可疑菌落,研混于大豆凝集素稀释液内成浓厚菌液,持续搅拌2～3min。c.加一滴5％兔血球悬液,搅匀,前后倾动玻片3～5min,观察血球是否凝集。6.4.1.2判定＋＋＋＋：血球凝集成块状,均匀散布,液体无色。＋＋＋：血球凝集成大颗粒,均匀散布,液体无色。＋＋：血球凝集成颗粒,均匀散布,液体无色。＋：血球凝集成细小颗粒,均匀散布,液体无色。±：血球凝集成细微颗粒,均匀散布,液体呈不显著黄红色。－：血球不凝集,摇动后汇集于中央,呈淡黄红色,液体呈不显著黄红色。注：“＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。6.4.2噬菌体裂解试验6.4.2.1方法a.用营养琼脂平板的皿底外面画三个直径约30mm,相隔约20mm为圆圈。b.用接种环取可疑炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物涂满与两个圆圈相对应的琼脂表面。另取已知炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物,涂满与第三个圆圈相对应的琼脂表面,作上区分的标记。c.待菌液被吸干后,在接种被检菌的圆圈内,一个加一滴无菌肉汤,另一个加一滴炭疽杆菌噬菌体。在接种已知炭疽杆菌的圆圈内,加一滴炭疽杆菌噬菌体。4食品标准网（）d.将平皿放入36±1℃恒温箱(隔架面要平,以防噬菌体液流散),微开皿盖,使液体迅速干燥。然后翻转平皿,培养12～18h。6.4.2.2判定a.加噬菌体的两个圆圈内都出现蚀斑,加肉汤的圆圈内无蚀斑,为阳性反应。b.加已知炭疽杆菌的圆圈内出现蚀斑,加被检菌的两个圆圈内无蚀斑,为阴性反应。c.三个圆圈内都无蚀斑,表明噬菌体已失效,应另换有效噬菌体进行试验。6.4.3串珠试验6.4.3.1方法a.取适量4～12h可疑炭疽杆菌肉汤培养物,接种于1.8mL肉汤管内(制备湿片在低倍显微镜下检查,每个视野应含菌链5～10条)。b.加5IU/mL青霉素0.2mL,使青霉素昀终浓度为0.5IU/mL。C.于37℃水浴培养1～2h,取出,加入20％福尔马林0.25mL,固定10min。d.制备湿片,在显微镜下检查。6.4.3.判定＋＋＋＋：菌体大而圆,均匀,排列整齐；＋＋＋：菌体圆,均匀,排列整齐；＋＋：菌体椭圆,排列整齐；＋：菌体均匀肿大,变粗；±：菌体大小不一,不圆,排列不整齐；－：菌体形态无变化。注：“＋＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。6.4.4动物试验6.4.4.1取可疑炭疽杆菌的肉汤培养物,用生理盐水稀释为10000个菌/mL(微混浊),接种2～3只小白鼠。一只于皮下注射0.1mL；其余每只于腹腔注射0.2mL。6.4.4.2如小白鼠死亡(通常于1～3d内),立即进行剖检,观察有无炭疽病理变化(如皮下胶样水肿,脾脏肿大,血凝不良),制备数张血液和腹水涂片,供做菌形检查,同时取病变材料或体液接种数管肉汤,以备核查。6.4.5染色镜检6.4.5.1染色液的配制A液：5食品标准网（）美蓝0.3g乙醇(95％)30.0mLB液：0.01％氢氧化钾溶液100mL将A、B两液混合而成。6.4.5.2染色方法a.将被检材料的涂片浸入固定液内15～20min；b.滴加染色液浸没涂膜,染色1～2min；c.用水冲去染色液,自然干燥或用吸墨纸吸干水分；d.镜检。6.4.5.3判定炭疽菌菌体呈蓝色,粗大杆状,两端平齐,相连成短链或成对,菌体周围以淡蓝紫色荚膜。7结果的判定和报告7.1结果的判定在菌落形态、细菌形态和肉汤生长特性三项中有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为非炭疽杆菌。在其余五项试验(确定试验)中有两项或更多项不符合炭疽杆菌特征时,判为非炭疽杆菌；全部符合或仅有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为有炭疽杆菌。7.2结果的报告7.2.1凡结果判为非炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验未发现炭疽杆菌”。7.2.2凡结果判为有炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验发现炭疽杆菌”。附录A培养基和试剂(补充件)A1溶菌酶多粘菌素琼脂(Knisely)营养琼脂(见A4)1000mL多粘菌素3000IU6食品标准网（）溶菌酶4mg/mL溶液10mL乙酸亚铊4mg/mL溶液10mLEDTA20mg/mL溶液10mL除营养琼脂外,将其他成分用灭菌蒸馏水配成适当贮备液,按以上量加于冷至50～55℃的灭菌营养琼脂内,充分摇匀,倾注平板。A2戊烷脒多粘菌素琼脂A2.1基础培养基牛肉膏3.0g蛋白胨20.0g氯化钠5.0g琼脂20.0g蒸馏水1000.0mL将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,调整pH至7.4,过滤,分装于三角烧瓶中,每瓶400mL,121℃高压灭菌20min。临时用加热融化,放于45～50℃恒温水浴内保温。A2.2戊烷脒稀释液称取戊烷脒0.1g,溶于4mL灭菌蒸馏水内。贮存在0～4℃冰箱,备用。A2.3多粘菌素稀释液取多粘菌素B一瓶,加灭菌蒸馏水使其溶解,再用灭菌蒸馏水将其稀释为3000IU/mL。贮存于0～4℃冰箱,备用。A2.4脱纤维羊血以无菌操作采羊血50～10mL,注入含玻璃小珠的灭菌三角烧瓶中,立即转摇数分钟。贮存于0～4℃冰箱,备用。A2.5完全培养基基础培养基(45～50)400.0mL℃戊烷脒稀释液0.4mL多粘菌素稀释液0.4mL脱纤维羊血8.0mL以无菌操作将后三种成分加入基础培养基内,充分摇匀,倾注于灭菌皿内,每皿15mL左右。7食品标准网（）A3营养肉汤．牛肉膏3.0g蛋白胨20.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸溜水中,调整pH至7.4,分装于试管内,每管1.0mL,121℃高压灭菌15min。A4营养琼脂牛肉膏3.0g蛋白胨20.0g氯化钠5.0g琼脂20.0g蒸馏水1000.0mL将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,补足失去的水分,调整pH至7.2,过滤,121℃高压灭菌20min。待冷至50℃左右时,倾注于平皿,制成平板。A5洗样液吐温-202.5mL蒸馏水1000mL将吐温-20加于蒸馏水中,充分搅匀,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌。贮存于0～4℃冰箱,备用。A6生理盐水氯化钠8.5g蒸馏水1000.00mL待氯化钠完全溶解后,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌20min。A7缓冲生理盐水无水磷酸氢二钠1.42g氯化钠8.50g蒸馏水1000.00mL8食品标准网（）将各成分加于蒸馏水中,加热搅拌使完全溶解。如欲长期保存,可加0.1g硫柳汞(昀终浓度为0.01％)。A8固定液无水乙醇600mL三氯甲烷300mL甲醛溶液(36％～38％)100mL将三种成分混匀,贮存于磨砂口带盖试剂瓶内。A9炭疽杆菌噬菌体γ或ω型的均可使用。A10革兰氏染色液及染色方法A10.1Hucker氏结晶紫液A液：结晶紫(或龙胆紫)2.0g乙醇(95％)20.0mLB液：草酸