截短制作

截短制作取质粒大肠杆菌菌液、摇菌、保种1.细菌-80°C冻存液于室温快速融化后放于冰上。从-20°C取出相应的抗生素FOXJ2-卡那-Kana，AUF1-氨苄-Amp。2.在超净工作台，左手取试管架上的LB液培试管过火，右手拿10ul的枪，其小指和无名指背夹软胶塞，取下软胶塞，软胶塞和管口都需要过火灭菌。3.倾斜LR试管，枪接上无菌白枪头，先加抗生素4ul，再加细菌4ul，注意更换枪头，可以将液体打在试管壁上，倾斜试管去够液体。4.LB液培：抗生素：细菌=4ml：4ul：4ul即（1000:1:1）5.软胶塞和试管口都过火后塞上，过火，放于37°C摇床250rpm14-16h，浑浊。挑斑1.打开LB液培管，软胶塞和试管口均需过火灭菌，倾斜用无菌枪头加入合适抗生素。2.用无菌白枪头挑取LB固培板上单个大菌落，入LB液培管中，注意不要挑到双菌落，放入液培管中不要碰到管壁。3.37°C摇床快摇转速250rpm，14-16h，出现浑浊。保种：每个灭菌的1.5mlEP管中先用细滴管加入约6滴灭菌甘油（4:1）200ul，再加入菌液800ul，混匀，-80°C保存。1.将液培试管中的菌种至2mlEP管中10000rpm离心1min，收集细菌弃上清，重复操作，最后EP管倒置用纸巾将管中剩余上清吸干。2.加入250ul的SolutionI（保存在冰箱中），用100ul的枪吹打混匀至重悬。3.加入250ul的SolutionII（用于裂解，注意配制的日期），慢摇颠倒6次左右混匀，呈澄清，静置1-2min。4.加入350ul的SolutionIII充分混匀，反复颠倒6次，出现绒毛白色絮状物。5.离心12021rpm*10min，准备其他东西，60°C预热灭菌ddH2O。6.将新的蓝色吸附柱放入2ml的无盖EP管中，小心完全将上清吸至蓝色吸附柱，并做好标记，贴壁加入，10000rpm离心1min。注意不能正柱子中心加，也不要一次放入太满的上清，防止破坏滤膜。再重复以上操作，将离心后滤下的收集管中的液体再吸入蓝色柱子，再次离心，弃去裂解液。7.在蓝色柱子里加入700ul的DNAwashbuffer，离心10000rpm*1min，弃去收集管中液体，再在蓝色吸附柱中加入等量DNAwashbuffer，再离心10000rpm*1min，弃去收集管中液体，可以换新的1.5mlEP管。8.在60°C恒温离心机中，将蓝色吸附柱盖子打开，空转3-5min，烘干。9.再更换一个新的1.5mlEP收集管，做好标记。10.向蓝色吸附柱.垂直靠近滴落30ul灭菌ddH2O，放入60°C烘箱烘干5min左右。11.离心13000rpm*2min，可重复一次，将收集管中的液体再次加入蓝色吸附柱中，以便充分将膜上的物质溶入水中。12.去除蓝色吸附柱。测浓度（nucleicacids）后-20°C保存。酶切1.采用20ul体系：冰上操作——酶拿出后立即置于冰上，且最后加入2.10*FDGreenBuffer2ul3.全长质粒DNA或者胶回收的全长DNA或酶切后地空载DNA1000/核酸浓度4.PCR跑胶回收的片段DNA或者片段酶切后跑胶后的片段200/核酸浓度（因为DNA核酸浓度是ng/ul，取得1ug的核酸就相当于1000/核酸浓度得到1ug核酸所需要多少ul）5.FOXJ2酶1：Xhol1ul酶2：BamH11ul6.AUF1酶1：Ecro11ul酶2：BamH11ul酶在三号冰箱下层—20°C保存，自取。7.灭菌ddH2O：约15ul，配平到20ul！反复枪吸混合，不可震荡！包装好放37°C水浴3小时。8.空载也需要酶切，并且设置空载的对照，就是说空载设为2个，一个是和DNA片段一样酶切的，一个是没有酶切的直接跑胶。Foxj2空载是EGFP，AUF1空载是FLAG。空载酶切的酶与所选分子酶切的酶一样。9.下一步再次跑胶以验证目的条带切除成功，并加以提纯。10.跑胶后的核算及时测浓度使用，不要保存太久，-20°C保存，很短时间4°C也可以，核酸浓度峰和蛋白峰类似，也至少在100以上，可以多PCR，以方便后续操作，如浓度太低，浓度峰也会有变化。PCR1.消毒0.2ml的EP管，黄、白枪头。高压蒸汽灭菌，再烘烤。（也可以不消毒。）2.按购置的引物EP管上的标签所示假如所需的ddH2O，从而配置合适浓度的引物。3.将上引物和下引物各吸取5ul加入到一个新的0.2mlEP管中，再加入90ul灭菌ddH2O，配置为100ul引物混合物。4.在冰上将以下成分按照从量多到少的原则加入至无菌已标记好的0.2mlEP管中。5.每个0.2mlEP管中分别依次加入2*TaqMasterMix25ul、22ul灭菌ddH2O、2ul引物混合物、1ul模板质粒。6.将上述混合物充分混匀后离心15秒使反应成分集于管底，后立即置于PCR仪上进行扩增。（最好当日跑胶，48h后条带不可用。）片段跑胶1.配跑胶电泳液：即1*TAE1000ml。2.配醇脂糖胶：用50*TAE2ml加上1.5g琼脂糖粉（Agarose-Moleculer白色（或把1.5g琼脂糖粉即加到1*TAE100ml中）。细粉），再加100ml灭菌dd水。3.加厚纸盖后，微波炉高火3-5min，室温冷却到60°C左右，在胶液中加入5ulEB，轻轻摇匀。（溴化乙锭，毒性物质使紫外线下发光）4.倒入槽子，插梳子，等冷却凝固。用手术刀将胶板贴壁切下，放入电泳槽中。5.向电泳槽中倒入跑胶电泳缓冲液，没过胶面1mm为宜，应设法除去气泡。6.在各泳道中加入约20ulDNAmarker（即DL2021marker在2号冰箱上层中），和50ul上样品，电压设置为150V恒定，电流最大值设置为400mA，大约15-40min）。多看以防DNA跑出胶块。7.酶切时跑胶时，空载也酶切跑胶，以便以后连接使用，可对照未酶切和已酶切。8.50*TAE配方：①称量Tris242g、乙二胺四乙酸二钠37.2g加入1L烧杯中；②向烧杯中加入约800mlddH2O，充分搅拌混匀；③加入57.1ml冰乙酸即冰醋酸，充分溶解；④加ddH2O定容至1L，室温保存。回收胶1.在紫外灯下切胶,纸巾吸尽凝胶表面的液体.应尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,提高DNA回收率，切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,防止DNA损伤，胶块切碎后可以加快胶块融化时间,提高DNA的回收率，装入2-5mlEP管中，标记，可放4°C冰箱中短暂保存。2.称重目的条带的胶块，按照1ul每1mg，的比例加入BindingBuffer。3.混匀后，将EP管放到60°C烘箱里加热直至完全融化，间断震荡混合，胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。4.融化后静置2-3min待EP管恢复至室温，12021rpm，室温离心1min。5.取粉色DNA吸附柱放入已标记好的空2mlEP管。将融化液体加入吸附柱中，12021rpm，1min，重复一次。6.弃滤液，在吸附柱里再加入300ulBindingBuffer12021rpm，室温离心1min。7.弃去滤液，在每个吸附柱中加入700ul的SPWwashbuffer，静置2-3min，再12021rpm，1min。重复一次。8.弃去滤液，在60°C离心机里吸附柱开盖离心，即空转离心，12021rpm，1min。9.再次弃去2mlEP管，吸附柱放入新的1.5ml的新EP管，在柱.垂直滴下30-50ul灭菌ddH2O，静置3min，再12021rpm，离心1min。10.测各管中DNA核酸浓度。并做好记录标记。连接1.连接为20ul体系：冰上操作！（连接酶易失活）2.10*T4连接Buffer2ul（白色管子，与酶切所用的酶放在同一个盒子里，保存于-20°C冰箱）T4连接酶（冰上！）1ul（红色管子）载体10-100ng，载体：DNA摩尔比为1:5到1:10左右3.因1pmol1000bp的DNA分子质量约0.66ug载体与片段摩尔比为：0.03pmol：0.3pmol载体体积为：（0.03×载体Kbp数目×660ng）/载体浓度片段体积为：（0.3×片段Kbp数目×660ng）/片段浓度FOXJ2片段：183；243；399；900AUF1片段：210；645；207再放于16°C水浴或者恒温箱16小时或者过夜。可以加冰，并注意保持温度，因为室温可能大于25度，水浴器只能加温，不能降温。转化1.事先将恒温水浴的温度调到42℃。2.准备制备含有(Amp-氨苄西林-AUF1;Kana-卡那霉素-FOXJ2)抗生素的LB固态平板。3.从-80℃超低温冰柜中取出所需（每管100μl）（1.5ulEP管）感受态菌，一管对应一个片段，冰浴5~10min（或者冰浴至化开）。4.至超净工作台，冰上操作，向感受态菌液中加入20μl连接好的截短片段质粒连接后的混合液（连接产物），轻轻震荡混匀后放置冰上45min。5.轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置2~3min，整个过程不要振荡菌液。6.在超净工作台中向上述各管中分别加入500μlLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡150rpm1h，3000rpm25°C离心3min留下约200ul涂板。涂板、挑斑1.在超净工作台中取上述转化混合液200μl，分别滴到已含有合适抗菌素的固体LB平板培养皿（1:1000）(Amp-氨苄西林-AUF1;Kana-卡那霉素-FOXJ2)中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，待玻璃棒消毒、灼烧、冷却后才可以使用。一直涂到固培板表面没有液体流动时。2.在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。或者直接37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。3.观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。注意挑白色菌斑。配置液培、固培1.称量：胰蛋白胨（Tryptone）1.0g，，酵母提取物（Yeastextract）0.5g，氯化钠1.0g，dd水定容至100ml。配制LB固体培养基时还需加1.0g琼脂粉（棕色，固态培养基用以分离鉴定计数保存菌种，液态培养基用于扩大培养）2.包器材：用小瓶装入丙三醇即甘油（如需要保种），盖子不必太紧；用布片或牛皮纸包裹玻璃培养皿，再用绳子扎好；每只试管标记好，约加入4mlLB液培，塞好软胶盖，不要过紧，不要加抗生素；剩下的液培选择合适量加入计量好的琼脂粉，转子搅拌均匀，倒入洗净烘干好的三角瓶，瓶口用3-4层锡箔纸包裹，绳子扎好，同甘油、试管连同试管架一并放入高压蒸汽灭菌锅120°C灭菌30min。至80°C以下可戴手套取出。3.倒平板：灭菌后，将培养皿，三角瓶，玻璃皿一起放入60°C烘箱烘干片刻，待固体培养基冷却至60℃左右时，将培养皿，三角烧瓶拿至超净工作台，还要准备记号笔，抗生素（如要制备含抗生素的平板，则在此时三角瓶加入抗生素，并摇匀，FOXJ2-卡那-Kana，AUF1-氨苄-Amp），在酒精灯火焰附近进行操作。其过程是：a)将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；b)右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；c)用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，每个培养皿倒入15ml到20ml，不等培养基覆盖全皿即可停止倒入，立刻盖上皿盖，待自然铺平；写上标记以及制作日期。d)待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，用塑料膜包裹封闭。可以暂时4°C冰箱保存备用。4.向培养皿中转移已灭菌的培养基时，不要把培养基沾在皿壁上。5.制作感受态细胞时使用的菌种，应使用-80℃保存的菌种