高二生物选修一-土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(63张ppt人教版)

温故知新无菌技术消毒：煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灭菌：灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、干热灭菌制备固体培养基的步骤定容称量溶化分装调pH包扎灭菌倒平板称量计算二、纯化大肠杆菌最常用的接种方法----1、平板划线法2、稀释涂布平板法还包括斜面接种、穿刺接种等方法。其核心都是要防止杂菌污染，保证培养物纯度。（一）、平板划线法：6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061、梯度稀释菌液：菌液微量移液器（二）、稀释涂布平板法：稀释103倍稀释104倍稀释105倍2、涂布平板：1、梯度稀释菌液：（二）、稀释涂布平板法：浸滴灼涂平板划线法和稀释涂布平板法的比较接种方法优点缺点平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延土壤所需微生物土壤--“微生物的天然培养基”土壤中微生物：数量最大、种类最多大约70%—90%是细菌分离一、课题背景1、尿素的利用2、细菌利用尿素的原因尿素是一种重要的农业氮肥。但尿素不能被农作物直接吸收。CO(NH2)2土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶+CO2+H2O芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌，及某些真菌和放线菌也能分解尿素。(了解)NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4+和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4+；土壤里的硝化细菌把NH3氧化为NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。(记)NH3土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。课题2土壤分解尿素的细菌的分离与计数1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌课题目的研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照一、研究思路(一)筛选菌种1、实例：PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。耐高温的酶耐高温生物体耐高温环境（热泉、火山口）寻找寻找Taq细菌【筛选原因】因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。美国黄石国家公园：热泉（一）筛选菌株耐寒微生物冰川分解石油的细菌油田【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。（3）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基（P22）15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素只有能产生脲酶的细菌才能以尿素作为氮源而生存。缺乏脲酶的微生物不能分解尿素，因缺乏氮源而不能生长繁殖从而受到抑制。①从物理性质看此培养基属于哪类？②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？③此培养基对微生物是否具有选择作用？固体培养基【选择培养基】在微生物学中，将允许______________________，同时_________________________生长的培养基。特定种类的微生物生长抑制或阻止其他种类微生物结果：培养一定时间后，能分解尿素的细菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。？怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果只生长尿素细菌生长多种微生物是③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养-可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下--分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。〖归纳总结〗选择培养基的选择作用(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某物理/化学因素的抗性不同而制备培养基。(2)方法：①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素---可以分离出酵母菌和霉菌，细菌不生长；加入高浓度的食盐---可以得到金黄色葡萄球菌。②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时--可以分离固氮微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。例1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦C(二）如何对细菌进行计数1、显微镜直接计数法：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下，计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点不能区分死菌与活菌（总菌计数）个体小的细菌在显微镜下难以观察显微镜血细胞计数板将一定体积的饮用水，用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基（EMB培养基）上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计算得出水样中大肠杆菌的数量。鉴别培养基2、滤膜法---活菌计数P26测定饮水中大肠杆菌数量稀释涂布平板法1、显微镜直接计数--不能区分死菌与活菌2、滤膜法---活菌计数3、间接计数法（活菌统计）---（二）统计菌落数目原理：（1个菌落←1个活菌）稀释涂布平板法3、成功的关键：恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。2、间接计数法（活菌统计）--当样品的稀释度足够高时，固体培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数。设置重复组--避免实验过程中偶然因素对实验结果的干扰。1、第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。2、第二位同学考虑到设置重复组的问题：涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果（21）与另2个结果（212,256）相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。设置重复组---【总结】（1）在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。（2）在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致。若结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。若三个结果比较接近，取三个平板的结果求平均值作为统计结果；（2）然后按公式计算每克样品中的菌株数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)M代表稀释倍数2.如何从平板上的菌落数，推测出每克样品中的菌株数？(1）统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计三个平板，计算出平板上菌落数的平均值，【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得三个平板上的菌落数的为233,234,235，那么每克样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（）A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4【解析】稀释倍数为106，0.1mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每克样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。B【总结】每克样品中的菌株数=（C÷V）×MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释倍数统计的菌落数往往比活菌的实际数目是高还是低？为什么？原因：当两个或多个细菌连在一起时，培养后平板上观察到的只是一个菌落。--【统计的菌落数往往比活菌的实际数目低】因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值，可将同一稀释度的菌液涂布到至少涂布三个平板，经培养计算出三个平板上的菌落平均值作为统计值。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。实例分析2A同学和其他同学所得实验结果差异如此之大，请分析原因可能有哪些？A同学和其他同学所得实验结果差异如此之大，请分析原因可能有哪些？①②【可能原因】（1）培养基污染（2）培养基混入了其他的含氮物质（3）土样不同方案三：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。方案二：配制牛肉膏蛋白胨培养基并接种A同学所用的土样，作为对照，以证明培养基是否混入了其他氮源（有选择作用）【可能原因】（1）培养基污染（2）培养基混入了其他的含氮物质（3）土样不同这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少（三）设置对照指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验。1、对照实验（P23）：自变量：无关变量：被测试的条件,人为加以改变。2、设置对照的目的（意义）：其他条件，相同且适宜。排除非测试因素(无关变量)对实验结果的影响，证明确实是测试条件（自变量）引起相应的结果，提高实验结果的可信度。实验流程：样品稀释、涂布平板微生物的培养与观察菌落计数三、实验设计土壤取样制备培养基土壤中分解尿素的细菌的分离与记数（一）土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3-8cm的土壤表层（1）从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。（2）先铲去表层土3cm左右，再从距地表3-8cm的土壤层取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封：在使用前都要灭菌。（二）制备培养基相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？筛选出能够分解尿素的细菌制备选择培养基（尿素为唯一氮源）检测选择培养基是否具有选择作用+制备牛肉膏蛋白胨培养基(对照组）【注意】每个稀释度下：需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基（对照原则）◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行（三）样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。◆分离不同的微生物,采用不同的稀释度分离土壤中细菌，选用104、105、106倍的稀释度分离土壤中放线菌，选用103、104、105倍的稀释度分离土壤中真菌，选用102、103、104倍的稀释度㈣.取样涂布◆第一次实验可将稀释度放宽一点，选择103---107倍的稀释液◆为什么分离不同的微生物采用不同的稀释度在干旱土壤中的上层样本中（单位：株/kg）：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。对于每个稀释度，还应增设一组空白对照组（牛肉膏蛋白胨培养基+土壤稀释液）㈣.取样涂布①由于选择的稀释倍数为103-107，每个稀释度下均需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外还需要准备灭菌的试管和灭菌的移液管②实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。涂布分离低浓度→高浓度，可不用换枪头（按照由107～103稀释度的顺序涂布平板，不必更换移液管）。移液的浓度由高到低时，移液管里残留的少量低浓度液对高浓度液影响极小涂布器移液管细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。按稀释倍数捆成一摞恒温37℃培养4、微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。（五）微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。将涂布好的培养皿放在37℃恒温箱中培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中;菌落的数量、形态等，并做好记录。当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。5.细菌的计数【公式】每克样品中的菌株数=（C÷V）×M◆如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的