蛋白质芯片

第四章蛋白质芯片技术第一节引言随着人类和其他生物的全基因组序列的完成,人们开始认识到基因仅仅是生物体遗传信息的载体,而生命活动的执行者、表观性状的体现者则由基因编码的产物一蛋白质所行使。基因只是一种编码,由它指导细胞合成蛋白质,而几乎所有的生物化学反应均发生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质参与,所有的外在表现均由种类繁多的蛋白质所决定。第一节引言越来越多的现象和证据显示,基因表达与细胞中蛋白质丰度以及蛋白质功能之间相关性并不完全一致,仅从基因组学角度的研究并不能得到生物功能的完整信息,蛋白质及蛋白质组研究的重要性和紧迫性日益显现,已经成为现代生命科学研究的重点和热点之一,蛋白质芯片作为一种高通量的蛋白质组研究技术也就应运而生。第一节引言越来越多的现象和证据显示,基因表达与细胞中蛋白质丰度以及蛋白质功能之间相关性并不完全一致,仅从基因组学角度的研究并不能得到生物功能的完整信息,蛋白质及蛋白质组研究的重要性和紧迫性日益显现,已经成为现代生命科学研究的重点和热点之一,蛋白质芯片作为一种高通量的蛋白质组研究技术也就应运而生。第一节引言与核酸相比,在生物体内起主要作用的蛋白质具有种类繁多、千变万化等特点,分析起来的难度大大超过了对核酸结构与功能分析。人们已经意识到,仅仅从基因组顺序尚不能完整预测蛋白质分子的多样性程度。蛋白质存在着多种不同的翻译后修饰现象,这些修饰包括磷酸化、糖基化、乙酰化和水解等。蛋白质一旦发生了修饰,其生物学功能、亲和性及细胞丰度等均会有所改变,甚至大相径庭。第一节引言相对于基因组学,蛋白质组(proteome)的概念提出较晚。1994年,在意大利举行的第一届国际双向电泳研讨会上,澳大利亚学者Wilkin和Williams首先提出了蛋白质组的概念。1999年最后一期Nature杂志将蛋白质组定义为在一个细胞的整个生命过程中所表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。目前,人们将蛋白质组定义为一个基因组、一个细胞或组织或一种生命体所表达的全部蛋白质。第一节引言蛋白质组学是蛋白质组概念的延伸,是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的学科。所以,与传统的蛋白质化学研究相比,蛋白质组的研究对象不再只是针对一种或几种蛋白质,而是着眼于全面性和整体性来研究生命体系内所有蛋白质的性质与功能。鉴于蛋白质研究的难度,蛋白质组学所采用的高通量和大规模的研究手段,在回答有关生命活动机制的基本问题方面达到了空前的规模和速度。蛋白质芯片(proteinchip),或称蛋白质微阵列(proteinmicroarray)技术就是顺应这一需要而发展起来的。第一节引言生物芯片基因芯片蛋白质芯片微流控芯片蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。第一节引言DNA芯片与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异相对于DNA芯片,蛋白质芯片技术面临更多困难。第一,相对于DNA的碱基配对杂交机制,蛋白质之间的相互作用呈现出更强的变化性。而且,蛋白质的活性以及相互作用的性质可能需要其它蛋白质的作用和翻译后修饰。第二,相对于PCR技术这样可以大量扩增DNA的技术,尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。第三,蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨,而且经常不能保持蛋白质的完整功能。最后,许多蛋白质很不稳定,给阵列制作本身带来很大的困难研究蛋白质芯片的意义蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面；探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。根据制作方法和用途蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片第二节蛋白质芯片的分类蛋白质检测芯片,又称为蛋白质分析芯片或蛋白质表达芯片。主要包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片、碳水化合物芯片等。它是将具有高度亲和特异性的探针分子(如单克隆抗体)固定在基片上,用以识别复杂生物样品溶液(如细胞提取物)中的目标多肽,当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后,通过激光共聚焦扫描或电荷耦合检测装置(CCD)对信号的强度进行检测,从而判断样品中靶分子的数量。如果蛋白质表达仅仅被控制在转录水平,那么DNA芯片可以部分地代替蛋白质芯片。如果应用于高通量、平行检测蛋白质表达水平,包括抗原抗体定量、半定量的检测时,基因芯片就无法替代。第二节蛋白质芯片分类第二节蛋白质芯片分类蛋白质功能芯片是研究蛋白质间、蛋白质修饰、DNA-蛋白质间、RNA-蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作用的芯片。它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片,用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。要了解体系中有哪些蛋白质能与蛋白质结合,则将制成的蛋白质功能芯片与荧光标记的蛋白质温育,经荧光显微镜扫描检测可知,芯片上的亮点即为蛋白质的潜在结合物。蛋白质功能芯片主要用来检测蛋白质的生物学活性。PoetzOet.al,MechanismsofgeingandDevelopment,2005,126,161–170.第二节蛋白质芯片分类二、根据检测试剂分类捕获分子常应用的有抗体、重组蛋白或纯化蛋白、肽、适配体等。不同捕获分子或检测试剂制成的蛋白质芯片,人们通常分别称为抗体芯片、蛋白质芯片、肽芯片、适配体芯片、小分子芯片等。为了检测自身抗体,自身抗原也被用作检测试剂。因此,这些类型的蛋白质芯片被称为自身抗原蛋白质芯片或抗原芯片。肽、适配体、小分子等是作为特殊检测试剂应用于蛋白质微阵列中的。第二节蛋白质芯片分类三、根据密度分类根据密度不同对蛋白质微阵列的分类比较简单,即低密度蛋白质芯片和高密度蛋白质芯片。密度的差异主要来自制备方法的不同。四、根据样本分类蛋白质芯片能够从不同的生物样品中检测到单一的蛋白质。因此,蛋白质芯片也被称为细胞溶解物蛋白质芯片、条件化培养基蛋白质芯片、血清蛋白质芯片、反相蛋白质芯片等。第三节蛋白质芯片技术提出生物学问题（实验目的）样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应化学偶合，加底物，反应温度和时间，冲洗条件检测（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）数据分析和建模（图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白质芯片制备6SchenaM,Proteinmicroarrays,2005,7.蛋白质芯片的制备1.固相载体及其处理载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）2.蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解3.点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等4.固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒，37°C1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白5.微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶状态行使功能的固相材料统称为载体。制作蛋白质芯片的载体材料必须符合下列要求:①载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团,以便于蛋白质分子进行偶联;②使单位载体上结合的蛋白质分子达到最佳容量;③载体应当是惰性的,并且有足够的稳定性,包括物理的、化学的和机械的稳定性。④载体具有良好的生物兼容性。目前适合作生物芯片载体的材料包括玻片、硅片、金片、聚丙烯酷胶凝胶膜、尼龙膜等。一、载体的选择及抗体或抗原的固化第三节蛋白质芯片技术载体上的生物分子固定化方法主要有两种:化学性固定化、生物性固定化。化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等;生物性配基包括受体、配体、酶、抗体-抗原等,它们的相应检测对象分别是:配体、受体、底物、抗原-抗体结合蛋白。待固定的生化分子(配基)可通过化学键直接固定,也可不直接通过化学键固定于载体之特异结合又不干扰其活性的分子偶联在载体上,再通过专一性、高亲和力作用间接固定配基,如第二抗体-第一抗体系统、蛋白A-抗体系统、生物素-抗生物素蛋白系统等。一、载体的选择及抗体或抗原的固化第三节蛋白质芯片技术为了成功地开发一种特异、敏感的蛋白芯片技术,捕获分子至关重要。理想的捕获分子应具有下列特点:对靶分子有高度的特异性和亲和力;容易进行生产和操作;具有可利用的大分子文库用来建立高度密集的微阵列;如果困难可以实现信号放大作用。就目前的捕获分子而言,尚无任何一种完全符合上述要求。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术1.抗体对以阵列为基础的蛋白质芯片来说,所应用抗体或蛋白质的收集是很关键的。蛋白质芯片的捕获分子或探针,可根据研究目的的不同,选用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。由于具有高度的特异性和亲和性,单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰度及确定新的蛋白质。传统的杂交瘤细胞技术用于单克隆抗体的研制所需时间长,制约了抗体阵列密度的发展。而基因工程抗体则给蛋白质芯片的发展带来了新的机遇。噬菌体抗体库技术就是典型的代表,它可以同时有效地处理大量的分子,而且抗体分子可以不经过动物的阴性选择,能从任一种属获得少有的抗体专一性和提高亲和力。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术2.寡聚核苷酸适配体,即寡聚核苷酸也能够作为捕获分子用于连接蛋白质,并且有很高的特异性和亲和力,也可在实践中应用。这种寡聚核苷酸能够用指数式富集法配体进化(SELEX)程序进行分离获得。尽管适配体的分离是一个非常复杂的过程,SELEX方案还是已被成功地进行了自动化。由于适配体可以通过人工合成获得,这样就能提供无限供应,并且容易使程序标准化。适配体的另一个特点是性质稳定,易于操作。通过任何一种捕获分子或程序均可以直接检测到蛋白质,并且能够从核酸(和固体载体)中区分开氨基酸功能基团。因此,在蛋白质微阵列技术应用中,适配体是非常具有前景的捕获分子。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术3.多肽与肽样寡聚体鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势,在蛋白质芯片系统中,多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。通过生物学方法或人工合成方法,能够获得多种多样的肽文库。通过筛选,人们可以从建立的文库中分离出蛋白结合多肽。这种方法的优点是,蛋白结合肽一旦被鉴定,可以通过人工合成的方法进行大规模制备,且成本较低。这一技术存在的问题是亲和力通常较低。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术肽样寡聚体。这种材料具有蛋白酶抗性,比较稳定,人工合成时比肽的合成操作简便、成本低廉。这些捕获分子同样存在着一个主要缺陷,即对靶蛋白亲和力低。为了提高肽对蛋白质的亲和力,现己发展了从展示在蛋白质表面的文库中发现多肽的方法。通过把肽结合于表面暴露的蛋白质环上来降低肽的游离程度,进而增加了其亲和力。蛋白结合肽也可通过酵母双杂交系统,在体内或体外进行筛选获得。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术4.小分子配体制备捕获分子最为有效的方式是小分子配体。通过化学人工合成的方法能够获得小分子配体,蛋白连接配体的供应非常简便,并使标准化成为可能。小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行。已鉴定了许多可作为治疗制剂的许多小分子配体,同时这些小分子配体也可应用于蛋白配体的研究中。小分子配体存在的问题也是其亲和力较低。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术5.重组蛋白纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子,特别是应用于在蛋白质功能分析方面,如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质-小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合蛋白的形式,从体外表达的细菌系统中分离纯化。最常用的融合蛋白表达系统是蛋白质与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸(HisX6)或二者的结合,标签(tag)的作用是利于纯化表达的融合蛋白。二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术蛋白质芯片既可通过自动化的机器制备,又可通过于工方法进行设计操作。研究者可以根据实验条件和研究目的进行选择。人工制备芯片主